sINDUCCIÓN IN VITRO DE RAÍCES DE Cinchona officinalis L., A PARTIR DE VITROPLANTAS
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Eras-Guamán Víctor1,2 Cueva-Coronel Claudia Milena1 Yaguana- Arévalo Magaly2 Poma-Angamarca Ruth Alexandra2 Moreno-Serrano Jose Antonio2 |
1Carrera de Ingeniería Forestal. Facultad Agropecuaria y de Recursos Naturales Renovables. Universidad Nacional de Loja, Loja-Ecuador. 2Laboratorio de Micropropagación Vegetal. Facultad Agropecuaria y de Recursos Naturales Renovables. Universidad Nacional de Loja, Loja-Ecuador.
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*Autor para correspondencia: victor.eras@unl.edu.ec
https://doi.org/10.54753/blc.v11i2.1006
Recibido: 06-07-2021
Aprobado: 12-11-2021
RESUMEN
Cinchona officinalis L., Árbol Nacional del Ecuador conocido por sus propiedades medicinales contra la malaria, presenta limitaciones para la propagación in vivo; es por ello, que la propagación in vitro se presenta como una técnica alternativa para la multiplicación y conservación de la especie. En este contexto, se instalaron dos ensayos con siete tratamientos cada uno, en el primero se evaluó el balance hormonal auxínico compuesto por AIB y 2,4-D; y, en el segundo se evaluó la interacción auxina (AIB)-citocinina (BAP), en concentraciones de 0.5 y 1.0 mg L-1 respectivamente. Las variables evaluadas fueron: días al enraizamiento, porcentaje de enraizamiento, número de raíces por explante y longitud de raíces. El tratamiento T2 conformado por 0.5 mg L-1 de AIB + 0 mg L-1 de BAP fue el más efectivo, presentó enraizamiento del 70 %, obtuvo el mayor número de raíces por explante con 4.67 y, alcanzó la mayor longitud promedio de raíces con 1.2 mm. El enraizamiento se presentó por organogénesis directa.
Palabras clave: Cinchona officinalis L., inducción, enraizamiento, explantes, balance hormonal.
ABSTRACT
Cinchona officinalis L., National tree of Ecuador known for its medicinal properties against malaria, has limitations for in vivo propagation; that is why in vitro propagation is presented as an alternative technique for the multiplication and conservation of the species. In this context, two trials were installed with seven treatments each. In the first, the auxin hormonal balance composed of IBA and 2,4-D was evaluated; and, in the second, the auxin (AIB) -cytokinin (BAP) interaction was evaluated, at concentrations of 0.5 and 1.0 mg L-1, respectively. The variables evaluated were: days to rooting, percentage of rooting, number of roots per explant and root length. Treatment T2 made up of 0.5 mg L-1 of IBA + 0 mg L-1 of BAP was the most effective, it presented 70% rooting, obtained the highest number of roots per explant with 4.67 and reached the highest average root length with 1.2 mm. Rooting occurred by direct organogenesis.
Keywords: Cinchona officinalis L., induction, rooting, explants, hormonal balance.
INTRODUCCIÓN
Cinchona officinalis L., planta medicinal conocida como quina o cascarilla, es una especie nativa del bosque siempreverde montano bajo de la Cordillera Oriental y Occidental de los Andes (Lozano, 2015). Entre las propiedades medicinales que posee se mencionan: la acción contra la malaria o paludismo, su acción astringente, es apropiada para las gangrenas, los problemas musculares (Fernández et al., 2004), y su efecto positivo en la protección contra el cáncer de riñón (El Naggar, 2010). Dada su importancia histórica, en 1936 C. officinalis L., fue declarada por Misael Acosta Solís como "Planta Nacional del Ecuador" (Larreátegui y La Fuente, 2013).
Pese a la importancia histórica y económica que representó la especie para Loja y el país, no se ha dedicado mayores esfuerzos para su conservación, los bosques de cascarilla actualmente son escasos, debido a la sobreexplotación que sufrió la especie en el pasado (Tapia y De La Torre, 2013). C. officinalis L., presenta deficiente renegación natural, la cual no ha podido ser compensada con la utilización de técnicas convencionales de propagación; por un lado, el enraizamiento in vivo de estacas y acodos ha resultado deficiente (Jerez, 2017); y, por otro lado, el porcentaje de germinación de semilla es bajo, en sustrato de tierra se ha obtenido un porcentaje del 20 % (Montaño, 2016), mientras que al utilizar un sustrato de arena + tierra + turba en proporción 1:1:2, se ha obtenido el mayor porcentaje de germinación, con 30.74 % (Zari, 2018).
En este contexto, la propagación mediante el uso de la técnica de cultivo de tejidos vegetales in vitro, se constituye en una alternativa para propagar esta especie, debido a que permite incrementar su densidad poblacional por unidad de superficie, facilita la conservación del material biológico por periodos de tiempo prolongados, puede optimizar el uso de factores ambientales; y, conservar genotipos élites de especies promisorias (Domínguez et al., 2008).
Por ello, la presente investigación se realizó con la finalidad de aportar al conocimiento del cultivo in vitro de C. officinalis L., en la fase de enraizamiento, posibilitando la generación de información de base, para el desarrollo de planes de recuperación y conservación de la especie en su hábitat natural.
MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio
La investigación se desarrolló en el Laboratorio de Micropropagación Vegetal de la Universidad Nacional de Loja, dentro del proyecto macro: “Procesos morfogénicos utilizando técnicas biotecnológicas, para la mejora genética de Cinchona officinalis L., en la provincia de Loja”.
Selección del material vegetal
Se seleccionaron vitroplantas de Cinchona officinalis L., codificadas, provenientes del relicto boscoso del sector Uritusinga, árbol número cinco (figura 1). No fue necesario realizar la desinfección de las mismas, por cuanto las vitroplantas se desarrollaron en condiciones asépticas.
Figura 1. Vitroplantas de C. officinalis L.
Fuente: Proyecto de Investigación Cinchona-LMV-UNL y Cueva, C. 2020
Preparación del medio de cultivo, para el balance hormonal auxínico de AIB y 2,4-D
El medio de cultivo estuvo constituido por las sales minerales de Murashige y Skoog (MS, 1962), suplementado con Tiamina 1.0 mg L-1, Mio-Inositol 1.0 mg L-1, BAP 0.5 mg L-1, carbón activado 1.0 mg L-1, sacarosa como fuente de carbohidratos 2.0 %, agar como agente solidificante al 0.6 %. Los reguladores de crecimiento empleados fueron dos auxinas, Ácido Indol Butírico (AIB) y Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) en diferentes concentraciones (Tabla 1).
Preparación del medio de cultivo, para el balance hormonal auxina (AIB)-citoquinina (BAP)
El medio de cultivo estuvo constituido por las sales minerales de Murashige y Skoog (MS, 1962), suplementado con Thiamina 1.0 mg L-1, Mio-Inositol 1.0 mg L-1, sacarosa como fuente de carbohidratos al 2.0 %, agar como agente solidificante al 0.6 %. Los reguladores de crecimiento empleados fueron Ácido Indol Butírico (AIB) y Bencil Amino Purina (BAP) en diferentes concentraciones (Tabla 1).
Tabla 1. Tratamientos evaluados para la inducción de raíces en explantes provenientes de vitroplantas de C. officinalis L.
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Tratamientos |
Reguladores del crecimiento |
|||
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Ensayo 1 |
Ensayo 2 |
|||
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AIB (mg L-1) |
2,4-D (mg L-1) |
AIB (mg L-1) |
BAP (mg L-1) |
|
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T0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
|
T1 |
0.0 |
0.5 |
0.0 |
0.5 |
|
T2 |
0.5 |
0.0 |
0.5 |
0.0 |
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T3 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
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T4 |
0.5 |
1.0 |
0.5 |
1.0 |
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T5 |
1.0 |
0.5 |
1.0 |
0.5 |
|
T6 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
Fuente: Proyecto de Investigación Cinchona-LMV-UNL y Cueva, C. 2020
En los dos ensayos se evaluó siete tratamientos incluido el testigo de control, con tres repeticiones cada uno. El pH del medio de cultivo se ajustó de 5.6 a 6.0 con HCL o NaOH 1 N. El medio de cultivo fue distribuido en frascos de vidrio a razón de 30 ml, posteriormente se esterilizó en autoclave a 120 ºC de temperatura y 1.5 kg/cm2 de presión, durante 20 minutos.
Inoculación in vitro de explantes y condiciones de incubación
La inoculación in vitro de los explantes de C. officinalis L., se realizó en cámara de flujo laminar en condiciones de asepsia, con ayuda de materiales de disección (cajas petri, bisturís, tijeras y pinzas) estériles. Se diseccionaron los explantes de tres a cuatro centímetros de longitud, tomando en cuenta los ápices caulinares y segmentos nodales; posteriormente, se procedió a colocarlos a razón de dos explantes por frasco. Se identificó cada uno de los tratamientos, y fueron llevados al cuarto de incubación, donde permanecieron en un fotoperiodo de 16 horas luz y ocho horas de oscuridad, a una temperatura 23 ºC, por el lapso de 90 días (Figura 2).
Figura 2. Inoculación in vitro de los explantes en el medio de cultivo MS-1962 + AIB y BAP. A) Materiales utilizados para la inoculación, B) Vitroplanta de C. officinalis L., C) Disección de los explantes, D) Explante, E) Identificación de frascos, F) Ensayo en área de incubación.
Fuente: Proyecto de Investigación Cinchona-LMV-UNL y Cueva, C. 2020
Diseño experimental
Se utilizó un diseño completamente al azar (DCA), compuesto por siete tratamientos incluido el testigo de control, con tres repeticiones cada uno, a continuación, en la Tabla 2 se detallan las especificaciones del diseño experimental, implementado para la evaluación de los ensayos.
Tabla 2. Especificaciones del diseño experimental.
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DESCRIPCIÓN |
UNIDAD |
|
Unidad experimental |
Explante |
|
Número de explantes frasco |
2 |
|
Número de tratamientos |
7 |
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Número de repeticiones |
3 |
|
Número total de frascos por repetición |
5 |
|
Número total de unidades experimentales por repetición |
10 |
|
Número total de frascos por tratamiento |
15 |
|
Número de unidades experimentales por tratamiento |
30 |
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Número de frascos del ensayo |
105 |
|
Número de unidades experimentales del ensayo |
210 |
Fuente: Proyecto de Investigación Cinchona-LMV-UNL y Cueva, C. 2020
Las evaluaciones se realizaron por observación directa, con intervalos de cinco días, a partir del tercer día hasta los 90 días después de la inoculación in vitro de los explantes. En la Tabla 3 se muestran las variables evaluadas en cada objetivo.
Tabla 3. Variables evaluadas en la fase de inducción de raíces, en explantes de C. officinalis L.
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Variables |
Balance hormonal de dos auxinas (AIB) y (2,4-D) |
Balance hormonal auxina (AIB) y citocinina (BAP) |
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Días al enraizamiento |
|
x |
|
Porcentaje de enraizamiento |
x |
x |
|
Número de raíces por explante |
x |
x |
|
Longitud de raíces |
x |
x |
Fuente: Proyecto de Investigación Cinchona-LMV-UNL y Cueva, C. 2020
Análisis estadístico de datos
Los datos obtenidos de las variables evaluadas, se analizaron en el software IMB SPSS Statistics versión 2020 para probar supuestos de normalidad. En el software InfoStat versión 2019, se realizó un análisis de varianza con el objetivo de identificar la existencia de diferencias significativas en las medias y varianzas de cada uno de los tratamientos.
RESULTADOS
Enraizamiento in vitro de los explantes de Cinchona officinalis L.: Los resultados obtenidos para el porcentaje de enraizamiento fueron relativamente bajos, en el primer ensayo donde se evaluó la concentración hormonal de dos auxinas, se alcanzó un porcentaje de enraizamiento de 10 %, en el tratamiento T6 (1.0 mg L-1 AIB + 1.0 mg L-1 2,4-D); mientras tanto, en el segundo ensayo el tratamiento T2 (0.5 mg L-1 de AIB + 0 mg L-1 de BAP) resultó ser más efectivo, presentó el mayor porcentaje de enraizamiento, con 70 % (Tabla 4).
Tabla 4. Resultados de la variable porcentaje de enraizamiento en cada uno de los ensayos.
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Tratamiento |
Ensayo 1 |
Ensayo 2 |
||
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AIB +2,4-D |
AIB+BAP |
|||
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Medias |
Rangos |
Medias |
Rangos |
|
|
T0 |
0.0 |
A |
0.0 |
A |
|
T1 |
0.0 |
A |
0.0 |
A |
|
T2 |
0.0 |
A |
70.0 |
B |
|
T3 |
6.67 |
A |
0.0 |
A |
|
T4 |
3.33 |
A |
0.0 |
A |
|
T5 |
3.33 |
A |
0.0 |
A |
|
T6 |
10.0 |
A |
0.0 |
A |
Fuente: Proyecto de Investigación Cinchona-LMV-UNL y Cueva, C. 2020
Número de raíces por explante: En cuanto a esta variable, en el primer ensayo donde se evaluó la concentración hormonal de dos auxinas, el tratamiento T6 (1.0 mg L-1 AIB + 1.0 mg L-1 2,4-D) formó en promedio 0.3 raíces por explante; mientras que, en el segundo ensayo en el cual se evaluó la concentración hormonal auxina-citocinina, el tratamiento T2 (0.5 mg L-1 AIB + 0 mg L-1 BAP) formó un mayor número promedio con 4.67 raíces (Tabla 5).
Tabla 5. Número de raíces por explante en los tratamientos de cada ensayo.
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Tratamiento |
Ensayo 1 |
Ensayo 2 |
||
|
AIB +2,4-D |
AIB+BAP |
|||
|
Medias |
Rangos |
Medias |
Rangos |
|
|
T0 |
0.0 |
A |
0.0 |
A |
|
T1 |
0.0 |
A |
0.0 |
A |
|
T2 |
0.0 |
A |
4.67 |
B |
|
T3 |
0.1 |
A |
0.0 |
A |
|
T4 |
0.2 |
A |
0.0 |
A |
|
T5 |
0.07 |
A |
0.0 |
A |
|
T6 |
0.3 |
A |
0.0 |
A |
Fuente: Proyecto de Investigación Cinchona-LMV-UNL y Cueva, C. 2020
Longitud promedio de raíces por explante: En el primer objetivo el tratamiento T4 conformado por 0.5 mg L-1 (AIB) + 1.0 mg L-1 (2,4-D), alcanzó una longitud promedio de raíces de 0.8 mm; mientras que, en el segundo objetivo el tratamiento T2 compuesto por 0.5 mg L-1 de AIB + 0 mg L-1 de BAP alcanzó una longitud mayor, con un valor de 1.2 mm (Tabla 6).
Tabla 6. Resultados de la variable longitud de raíces por explante.
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Tratamiento |
Ensayo 1 |
Ensayo 2 |
||
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AIB +2,4-D |
AIB+BAP |
|||
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Medias |
Rangos |
Medias |
Rangos |
|
|
T0 |
0.0 |
A |
0.0 |
A |
|
T1 |
0.0 |
A |
0.0 |
A |
|
T2 |
0.0 |
A |
1.2 |
B |
|
T3 |
0.7 |
A |
0.0 |
A |
|
T4 |
0.8 |
A |
0.0 |
A |
|
T5 |
0.1 |
A |
0.0 |
A |
|
T6 |
0.2 |
A |
0.0 |
A |
Fuente: Proyecto de Investigación Cinchona-LMV-UNL y Cueva, C. 2020
En los tratamientos donde se probó la interacción auxina (AIB)-citocinina (BAP), se evidenció un efecto positivo en la formación de callo, más no en la formación de raíces adventicias en los explantes, presenciándose en estos tratamientos la formación de callo en la base de los explantes, a partir de los 18 días.
DISCUSIÓN
Enraizamiento in vitro de los explantes de Cinchona officinalis L.: Los resultados obtenidos en el primer ensayo con el T6 (1.0 mg L-1 AIB + 1.0 mg L-1 2,4-D) se obtuvo el 10 %; mientras que, en el segundo ensayo el T2 (0.5 mg L-1 de AIB + 0 mg L-1 de BAP) obtuvo el 70 %, es superior al obtenido por Paredes (2019) quien en un ensayo sobre enraizamiento in vitro de C. officinalis L., alcanzó los mejores resultados en la concentración hormonal conformada por 2.0 mg L-1 de AIB + 0 mg L-1 de BAP, con un porcentaje de enraizamiento de 46.11 %. El enraizamiento se presentó por organogénesis directa, que según Randel et al. (2015), consiste en la propagación a partir de explantes, sin fases intermedias y se induce artificialmente por medio de reguladores del crecimiento, generalmente empleando auxinas como ANA, AIA, 2,4-D y citoquininas; así también, Díaz (2012) en un estudio sobre enraizamiento in vitro de explantes de Cedrela montana, al utilizar la hormona AIB en concentraciones de 1.0 mg L-1, presentó enraizamiento de explantes por organogénesis directa. Las auxinas estimulan la formación de raíces in vitro en explantes de C. officinalis L., reafirmando lo señalado por Burgos et al. (2009) quienes manifiestan que el efecto de las auxinas produce fenómenos de iniciación y temprano desarrollo de raíces, incluso estimulación de raíces secundarias. De la misma manera, Castrillón et al. (2008) manifiestan que el uso de reguladores de crecimiento es una de las prácticas más comunes para inducir la formación de raíces adventicias, y los más usados son las auxinas, como los ácidos indolacético (AIA), naftalenacético (ANA) e indolbutírico (AIB); por tanto, la presencia de auxinas en el medio de cultivo es indispensable para la formación de raíces in vitro, y establece la posibilidad de mantener el potencial rizogénico de la especie en condiciones ex vitro (Uribe et al., 2012).
Número de raíces por explante: En el primer ensayo el T6 (1.0 mg L-1 AIB + 1.0 mg L-1 2,4-D formó 0.3 raíces por explante; y, en el segundo ensayo el T2 (0.5 mg L-1 AIB + 0 mg L-1 BAP) formó un número promedio con 4.67 raíces, resultado que fue superior al obtenido por Chamba (2017) quien al probar la hormona AIB en una concentración menor de 0.1 mg L-1 de AIB, obtuvo un número promedio de 0.24 raíces. De igual manera, este resultado fue mayor al obtenidos por Paredes (2019), quien al probar la misma hormona AIB en una concentración mayor, formada por 2 mg L-1 de AIB, alcanzó la formación de 2.77 raíces promedio por explante.
Longitud promedio de raíces por explante: En el primer ensayo el T4 (0.5 mg L-1 AIB + 1.0 mg L-1 2,4-D), alcanzó un promedio de raíces de 0.8 mm; y, en el segundo ensayo el T2 (0.5 mg L-1 de AIB + 0 mg L-1 de BAP) alcanzó 1.2 mm, resultados inferiores al obtenido por Paredes (2019), quien al aplicar la hormona AIB en concentración de 2 mg L-1, en explantes de C. officinalis L., provenientes del Sector Uritusinga, consiguió una longitud promedio de la raíces por explante de 2 mm, sin embargo, es una longitud pequeña para la adaptación ex vitro de las vitroplantas.
Cabe señalar, que en los tratamientos donde se probó la interacción de una auxina (AIB) y una citocinina (BAP), se evidenció formación de callo, más no de raíces adventicias en los explantes. Información que coincide por lo mencionado por Montoya (1991), quien señala que la formación de tejido callogénico puede ser estimulada por una variedad de auxinas a diferentes concentraciones, pero en muchos casos se hace necesario la interacción de una citocinina, para romper el balance hormonal endógeno y estimular una mayor formación de callo, en los explantes inoculados in vitro. Además, Guartanza (2019), en un estudio realizado sobre inducción de callos en C. officinalis L., comprobó que al combinar una auxina y una citocinina, se incrementó la formación de tejido callogénico en los explantes.
CONCLUSIONES
· En fase de enraizamiento in vitro de explantes de C. officinalis L., en la que se probó la combinación de dos auxinas, la concentración hormonal conformada por 0.5 mg L-1 de AIB + 0 mg L-1 de 2,4-D, perteneciente al tratamiento T2, fue el único tratamiento donde se alcanzó el mayor porcentaje de enraizamiento con un valor de 70 %, un promedio de 4.67 raíces por explante y una longitud promedio de las raíces de 1.2 mm, lo que significa que el número de raíces por explante fue abundante, pero el tamaño de las mismas fue pequeño.
· El enraizamiento in vitro en los explantes de C. officinalis L., se presentó mediante organogénesis directa, es decir, que no existió una fase intermedia de formación de estructuras callogénicas.
· En la mayoría de los tratamientos con la interacción auxina (AIB) y citocinina (BAP), a los 18 días de evaluación se obtuvo la formación de callo en la base de los explantes, más no la formación de raíces adventicias.
AGRADECIMIENTOS
A las Autoridades de la Universidad Nacional de Loja, y al Equipo Técnico del Laboratorio de Micropropagación Vegetal y del Proyecto de Investigación Cinchona, por el apoyo financiero, técnico, logístico y humano brindado para la ejecución de la presente investigación.
CONTRIBUCIÓN DE LOS AUTORES
Dirección del trabajo de investigación, planificación de actividades, redacción y revisión de las versiones del documento hasta la versión final, Ing. Víctor Hugo Eras Guamán, e Ing. Magaly Yaguana Arévalo; Trabajo de laboratorio y levantamiento de información de ensayos, Ing. Magaly Yaguana Arévalo, Ing. Ruth Alexandra Poma Angamarca e Ing. Claudia Milena Cueva Coronel; levantamiento de información, análisis, interpretación, y redacción del manuscrito, Dr. Jose Antonio Moreno Serrano e Ing. Claudia Milena Cueva Coronel; apoyo técnico y logístico en el Laboratorio de Micropropagación Vegetal, Ing. Magaly Yaguana Arévalo e Ing. Ruth Alexandra Poma Angamarca.
CONFLICTO DE INTERESES: No existe conflicto de intereses en los autores del presente manuscrito.
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