Estado actual del uso de marcadores moleculares en el diagnóstico y control genético de enfermedades de naranjilla
Current status of the use of molecular markers in the diagnosis and genetic control of diseases of Solanum quitoense
Castro-Quezada Patricio1*
Belesaca-Morocho Iván1
Díaz-Granda Lourdes1
1Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Cuenca, Cuenca, Ecuador
*Autor para correspondencia: patricio.castro@ucuenca.edu.ec
https://doi.org/10.54753/blc.v11i2.1063
Recibido: 17-08-2021
Aprobado: 27-10-2021
RESUMEN
La naranjilla o lulo (Solanum quitoense) es un importante cultivo frutal originario del noroeste de Sudamérica que se siembra principalmente en Colombia y Ecuador. Este cultivo tiene cada vez tiene mayor demanda a nivel mundial. Sin embargo, es muy susceptible al ataque de plagas y enfermedades. En el Ecuador, los principales patógenos que atacan a la naranjilla son Fusarium oxysporum, Meloidogyne incognita. Además, se ha detectado un virus de la familia Tymoviridae, a la que se denominó Naranjilla chlorotic mosaic virus (NarCMV) y un viru que causa mosaico al que se ha denominado Naranjilla mild mosaic virus (NarMMV). La presencia de estos patógenos ha sido detectada con el uso de diferentes técnicas moleculares. El presente reporte presenta el estado actual en el uso de marcadores moleculares, tanto en el diagnóstico de enfermedades, como en la detección de información relacionada a la resistencia en el cultivo de naranjilla.
Palabras clave: Naranjilla, marcadores moleculares, enfermedades de la naranjilla
ABSTRACT
Naranjilla or lulo (Solanum quitoense) is an important native fruit crop to northwestern South America. It is planted mainly in Colombia and Ecuador and is increasingly in demand worldwide. However, it is very susceptible to attack by pests and diseases. In Ecuador, the main pathogens that attack naranjilla are Fusarium oxysporum and Meloidogyne incognita. In addition, a virus of the Tymoviridae family has been detected, which was called Naranjilla chlorotic mosaic virus (NarCMV) and a viru that causes mosaic that has been called Naranjilla mild mosaic virus (NarMMV). Presence of these pathogens has been detected in using different molecular techniques. This report presents the current status in the use of molecular markers, both in diagnosis of diseases and in detection of information related to resistance in naranjilla crop.
Keywords: Naranjilla, molecular markers, naranjilla diseases
Introducción
La naranjilla o conocido como “lulo” en Colombia es un importante cultivo frutal en Ecuador. Según Whalen y Caruso (1983) las solanáceas de la sección Lasiocarpa se encuentran principalmente en el noreste de Sudamérica y el origen de la naranjilla posiblemente esté entre Colombia y Ecuador (Council, 1989). Es una planta herbácea perenne que pertenece a la familia Solanaceae y cuyo fruto tiene un sabor ácido y exótico (Ramírez et al., 2018).
La naranjilla es considerada como un cultivo con un gran potencial económico. Se utiliza principalmente para hacer jugos, helados, jaleas y otros dulces (Heiser, 1993). Además, se ha encontrado que los frutos de naranjilla presentan compuestos benéficos para la salud, como antioxidantes, carotenoides, compuestos fenólicos, 13-cis-β-caroteno, 9-cis-β-caroteno, trans-β-caroteno, luteína, ácidos clorogénicos, hexósidos en la pulpa y glucósidos de flavonol en la corteza (Gancel et al., 2008; Lim, 2013). También es fuente de vitaminas E, C, B1, B2, B3, B6, provitamina A, minerales (hierro, calcio, fósforo, potasio y nitrógeno), carbohidratos y proteínas (Pratt et al., 2008).
En la Amazonía ecuatoriana la naranjilla constituye una importante fuente de ingresos económicos para los agricultores debido a las condiciones adecuadas para el desarrollo del frutal. La principal variedad cultivada en la Amazonía del Ecuador es S. quitoense Var. quitoense sin espinas. Los cultivares que más se siembran y comercializan son: el híbrido Puyo (61%), híbrido Palora (38 %) y la variedad común (1 %) (Chong y Andrade, 2001).
Enfermedades de a naranjilla
La naranjilla a pesar de las inmensas perspectivas de crecimiento en los mercados internacionales se ha visto limitada por la susceptibilidad de las plantas a diferentes plagas y enfermedades. Estos problemas tradicionalmente se resuelven desmontando áreas vírgenes para establecer nuevos cultivos o con la aplicación de productos químicos. Existen diversos estudios que muestran que el uso de sustancias agroquímicas para el control aumenta los costos de producción y también se ha encontrado residuos químicos en las frutas (Sowell y Shively, 2012; Clements et al, 2017). El hongo F. oxysporum y los nematodos del nudo de la raíz se han considerado las enfermedades más importantes de la naranjilla (Dennis et al., 1985; Mosquera-Espinosa, 2016); sin embargo, en los últimos años se ha logrado la identificación de enfermedades virales mediante técnicas de biología molecular (Vaca et al., 1999; Gallo et al., 2018).
Pudrición radicular
Uno de los principales problemas en la naranjilla es la marchitez vascular, causada principalmente por Fusarium oxysporum que puede llegar a ocasionar hasta un 80% de pérdidas en el cultivo (Alwang et al., 2002). Se ha demostrado en diversos cultivos que las pérdidas económicas pueden incrementarse cuando se presenta la interacción entre el hongo y el nematodo Meloidogyne incognita. Esta interacción se caracteriza por producir una mayor agresividad y un incremento más rápido de la enfermedad (Meena et al., 2016; Kumar et al., 2017; Khan y Sharma, 2020).
La caracterización de aislados del hongo F. oxysporum tradicionalmente se ha realizado en base a sus características morfológicas y fenotípicas. No obstante, se ha determinado que los aislados pueden llegar a ser indistinguibles basados únicamente en sus características morfológicas. Así, aislados que pertenecen a una raza particular o una forma especializada del hongo o forma specialis (abreviación. f. sp.) no se podrían distinguir de aquellos aislados no patógenos (Boix-Ruíz et al., 2015).
Figura 1. Sintomas del ataque de F. oxysporum en naranjilla. A: clorosis en las hojas. B: flacidez generalizada de toda la planta. C y D: daños en el sistema vascular presente en el tallo y raíz (Fuente: Reyna, 2021).
Dentro de los planes de diagnóstico y manejo de una determinada enfermedad en la actualidad, es necesario identificar adecuadamente la raza o forma especializada del agente causal (Leslie y Summerell, 2006; Gao y Zhang, 2013). Para el caso de las solanáceas, no existen al día de hoy condiciones estandarizadas que aseguren la identificación de una raza o forma especializada de F. oxysporum en base a características morfológicas, por lo que el uso de técnicas moleculares se considera una importante herramienta complementaria para identificar el agente causal de una enfermedad.
En la identificación de formas especializadas y razas de F. oxysporum se ha empleado varios métodos moleculares como RAPD (Random amplification of polymorphic DNA), ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) y RFLP-IGS (Restriction fragment length polymorphism of intergenic spacers) (Çolak y Biçici; 2013; Oliveira et al., 2013). Sin embargo, actualmente se utilizan principalmente dos técnicas: RFLP y PCR. Estas técnicas requieren cebadores específicos para cada forma especial o razas y se basan en la detección de un conjunto de pares de bases que están presentes solo en esa f. sp (Boix-Ruíz et al., 2015).
Por ejemplo, con el uso de marcadores moleculares se ha detectado que que la f. sp. lycopersici (raza Fol) de F. oxysporum segrega varias proteínas únicas, llamadas proteínas "secretadas en el xilema" (Six) durante el proceso infeccioso (Boix-Ruíz et al., 2015). Lievens et al. (2009b) utilizaron varias proteínas Six para la identificación de formas especializada y razas de F. oxysporum basados en genes de virulencia específicos del huésped. Sus resultados experimentales permitieron el desarrollo de marcadores específicos para estas proteínas, y sus estudios han demostrado que la presencia de la proteína SIX1 puede utilizarse para la identificación inequívoca de la forma specialis lycopersici. Además, SIX4 se puede utilizar para la identificación de cepas de la raza 1, mientras que los polimorfismos en SIX3 se pueden aprovechar para diferenciar las cepas de la raza 2 de la raza 3 infeccioso (Boix-Ruíz et al., 2015).
También se ha desarrollado un método PCR con cebadores específicos, basado en los polimorfismos en dos genes que codifican enzimas que degradan la pared celular (endopoligalacturonasa y exopoligalacturonasa), para distinguir aislados japoneses de F. oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) de F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Forl) (Hirano y Arie, 2006).
Virosis
Las enfermedades causadas por virus en la naranjilla causan pérdidas económicas importantes. Pueden presentar en la naranjilla síntomas como enanismo, amarillamiento, mosaico, enrollamientos de los bordes (Vaca et al., 1999).
En Colombia, se ha detectado la presencia de potivirus en muestras recolectadas en localidades del Departamento de Cundinamarca con la aplicación de dos metodologías: análisis de ARN de doble cadena (dsRNA) y ensayos de RT-PCR empleando cebadores específicos. Se detectó la presencia de potivirus en algunas de las muestras estudiadas, sin embargo, no se encontró correlación entre su aparición y el desarrollo de sintomatología (Vaca et al., 1999).
También se ha determinado la presencia de tres virus de ARN en la naranjilla: el Cucumber mosaic virus (CMV), el Potato yellow vein virus (PYVV); y el Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV) con plantas cuyos síntomas incluyen amarillamientos intervenales, mosaicos en las hojas y deformación de brotes. Los tres virus en naranjilla fueron determinados mediante pruebas de RT-PCR y secuenciación Sanger con cebadores específicos diseñados a partir de los datos de NGS (ANSV y CMV), o con cebadores reportados previamente (PYVV) (Gallo et al., 2018).
Figura 2. Síntomas inducidos por aislados virales de naranjilla en plantas de S. quitoense. A: arrugamientos moderados. B: anillos cloróticos y clorosis intervenal. C: clorosis y enrollamiento de la hoja. D: mosaicos. E: necrosamiento de tejido del ápice de los brotes nuevos. (Fuente: Martínez, 2021).
En Ecuador se ha reportado que diferentes especies de virus causan síntomas en la naranjilla. (Green et al., 2017) reportaron en el cultivar híbrido puyo la primera especie de virus en naranjilla ubicada en la familia Tymoviridae, a la que denominaron como “Naranjilla chlorotic mosaic virus” (NarCMV). El virus produjo mosaico, retraso en el crecimiento, manchas cloróticas en las hojas superiores, necrosis y senescencia, dejando una superficie de hoja perforada. Además, este virus infecta a otras especies de solanaceas como: N. benthamiana, berenjena, tomate de árbol, pimiento, con síntomas similares a los mostrados en naranjilla. El genoma entero de 6245 nucleótidos fue amplificado usando RT-PCR y secuenciado utilizando usando la metodología Sanger. Se encontró que el genoma tenía tres ORF típico de los tymovirus. Cornejo-Franco et al. (2019) reportaron en el norte de Ecuador un virus que se presenta con mosaicos moderados en naranjilla, al cual lo denominaron como “Naranjilla mild mosaic virus” (NarMMV) usando RT-PCR y el cual fue secuenciado usando la metodología Sanger.
Nematodos
Los nematodos son parásitos que infectan las raíces de las plantas e inducen la formación de células gigantes de alimentación que conducen a una disminución en la nutrición de las plantas y la absorción de agua. Constituyen un grupo importante de patógenos y causan una pérdida de rendimiento del 7 al 15% en los cultivos agrícolas. Como consecuencia, las plantas pueden mostrar varios síntomas como marchitamiento, retraso del crecimiento, y con rendimientos considerablemente reducidos (Barbary et al., 2015; El-Sappah et al., 2019).
Los nematodos, además de causar daño directo a las plantas, también poseen la capacidad de sinergizarse con otros patógenos que conducen al desarrollo del complejo patológico. La invasión de nematodos puede aumentar la gravedad de enfermedades fúngicas o bacterianas. Los complejos de enfermedades de Fusarium-nematodos que involucran nematodos agalladores, Meloidogyne spp. son muy frecuentes y muy dañinos para los cultivos (Khan & Sharma, 2020).
En el caso de la naranjilla, frente a estos problemas de enfermedades que incluyen a los nematodos es común entre los agricultores la práctica de utilizar la tierra para el cultivo de naranjilla mientras su productividad es alta, y cuando esta desciende después de unos años debido a la presencia de enfermedades convertirla la tierra en pastos (Grijalva, 2005). Los nematodos agalladores (Meloidogyne spp.) son las plagas de nematodos más importantes del mundo, tanto debido a su amplia distribución y al elevado número de familias y especies de plantas que se ven afectadas, siendo el caso de los cultivos frutales comerciales en Ecuador como la naranjilla. En naranjilla, los fitonematodos del género Meloidogyne son los de mayor frecuencia y distribución. Estos causan daño mecánico permitiendo la llegada de otros patógenos y cuya sintomatología en la parte aérea de la planta se observan como marchitez generalizada (Gelpud et al, 2011).
Dennis et al. (1985) señalan que las plantas a menudo disminuyen después de dos o tres años de producción, más debido a las plagas que al verdadero envejecimiento de la planta y que el injerto de naranjilla en patrones resistentes a los nematodos podría aumentar la longevidad y la productividad de la planta. El deterioro de la planta es progresivo, se observan hojas cloróticas, defoliación y marchitez, reducción del tamaño de frutos y del periodo de producción, finalmente las plántulas mueren. Lo anterior se relaciona con la reducción en la absorción de nutrientes por el deterioro del sistema radical inducido por las agallas que provoca Meloidogyne spp. (Mosquera-Espinoza, 2016). El control de nematodos se hace generalmente con productos químicos, pero estos no son deseables para su uso en la agricultura debido a sus altos costos y efectos peligrosos sobre la salud humana y el medio ambiente, pues reducen la biodiversidad del ecosistema (Castro et al., 2011).
Figura 3. Raíces de naranjilla que presentan deformaciones y agallas debido a la presencia de Meloidogyne incognita. (Fuente: Pacheco, 2019).
Dentro del campo de la biología molecular no existen muchos estudios acerca de las interacciones entre la naranjilla y los nematodos de agallas. Se han utilizado cebadores específicos MI-F y MI-R para amplificar segmentos de ADN para confirmar a M. incognita como le especie responsable del ataque a la naranjilla u otra solanáceas (Navarrete et al, 2018; Martinez et al, 2019).
Se han probado especies de solanáceas aparentadas a la naranjilla como S. hirtum, las cuales al ser evaluadas mostraron nudos en las raíces, síntoma característico de cultivos afectados por nematodos del género Meloidogyne, pero que presentaron valores para el factor de reproducción inferior a S. quitoense, y por lo tanto una respuesta de tolerancia (Navarrete et al, 2018).
Uso de marcadores moleculares en mejoramiento genético en naranjilla
La naranjilla presenta escasa variabilidad genética. Una de las colecciones más grandes de germoplasma de naranjilla se encuentra en Colombia (CORPOICA) (Ramírez et al, 2018). Esta colección ha sido analizada mediante marcadores AFLP y COSII (Fory Sánchez et al., 2010; Bedoya-Reina y Barrero, 2010; Enciso-Rodríguez et al., 2010). Fory Sánchez et al. (2010) examinaron los polimorfismos genéticos de la colección y afinidades interespecíficas utilizando marcadores AFLP. Se observó una variabilidad genética más amplia dentro de la sección silvestre de Lasiocarpa que en las especies cultivadas S. quitoense y S. sessiliflorum. También se observó que los híbridos interespecíficos entre S. hirtum y S. quitoense mostraron una mayor variabilidad genética en contraste con S. quitoense.
Bedoya-Reina y Barrero (2010) evaluaron la diversidad de secuencia relativa entre la naranjilla y su pariente silvestre S. hirtum, mediante el uso de marcadores COSII. La diversidad de la naranjilla cultivada fue considerablemente menor que la de su pariente silvestre. Algunos genes asociados con resistencia a patógenos y estrés abiótico con alta variabilidad genética se han visto favorecidos tanto en plantas de naranjilla cultivadas como silvestres. Además, Enciso-Rodríguez et al. (2010) caracterizaron genéticamente 62 accesiones de naranjilla mediante marcadores basados en PCR desarrollados a partir de genes ortólogos conservados de copia única (COSII) de especies de Solanaceae (Asterid). Encontraron seis marcadores COSII polimórficos para naranjilla con 47 alelos. El análisis genético proporcionó evidencia que indica una alta estructura poblacional, lo que podría ser el resultado de una baja migración entre poblaciones, la adaptación de nichos y la cantidad de marcadores analizados.
En Ecuador, con el fin de obtener materiales con mejores características de productibilidad y resistencia a las principales plagas y enfermedades desde el 2005 el Programa Nacional de Fruticultura del INIAP ha generado una población segregante proveniente de cruzamientos interespecíficos entre S. quitoense con solanáceas silvestres. El mejoramiento genético en el cultivo de naranjilla se ha apoyado en la observación tanto morfológica como fisiológica. Hasta el momento estudios realizados han demostrado que miembros de la sección Lasiocarpa como Solanum vestissimun y Solanum hirtum presentan diversos grados de resistencia a M. incognita y a F. oxysporum (Ramírez et al, 2018).
Estudios de la resistencia genética en la sección Lasiocarpa del género Solanum del banco de germoplasma del INIAP, muestran que accesiones especialmente de Solanum hirtum presentan una resistencia parcial a estos patógenos. La producción y uso de variedades o híbridos resistentes presentan ciertas desventajas como: la producción de semillas estériles. Además, los segregantes de estas cruzas no son totalmente resistentes a enfermedades, especialmente a la marchitez causada por F. oxysporum, lo que demuestra que el mejoramiento convencional en la naranjilla no ha solucionado los problemas de su cultivo y producción (Ramírez et al, 2018).
Perspectivas
En los últimos años, el uso de marcadores moleculares ha permitido la identificación de los agentes causales de plagas y enfermedades en el cultivo de naranjilla, con una mayor precisión, ya que en ciertos casos la identificación basada en características morfológicas o daños causados es muy difícil de realizar. Con los avances en el área de la biotecnología vegetal, como el uso de marcadores moleculares se abre la posibilidad de incorporar características deseables en el cultivo de naranjilla, aprovechando la diversidad, para conseguir un mejoramiento dirigido a satisfacer las necesidades específicas de los agricultores y consumidores. Es necesario recalcar que, dentro de un plan integral de manejo de la naranjilla, la resistencia genética es la estrategia más eficiente para el control de enfermedades y el mejoramiento de la calidad de la fruta en suelos donde están presentes tanto F. oxysporum como M. incognita.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan su agradecimiento a la Dirección de Investigaciones de la Universidad de Cuenca (DIUC) por el financiamiento para realizar este trabajo.
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