Caracterización
morfológica y molecular del agente causal de la antracnosis en tomate de árbol
en Azuay y Loja
Morphological
and molecular characterization of the causal agent of anthracnose in tree
tomato in Azuay and Loja
Patricio
Castro-Quezada1*, Catalina Bravo-Zuñiga2*, Aníbal
Cabrera-Cabrera1 Norma Quillay-Curay2, María Ramón-
Montoya1, Iván Belesaca-Morocho1 y Lourdes Diaz-Granda1
1. Facultad de Ciencias
Agropecuarias, Universidad de Cuenca, Cuenca, Ecuador.
2. Instituto
Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), Estación Experimental del
Austro. Laboratorio de Protección Vegetal, km 12 1/2 Vía a El Descanso -
Gualaceo sector Bullcay, Provincia Azuay, Cantón Gualaceo
Autor
de correspondencia: patricio.castro@ucuenca.edu.ec
RESUMEN
La
antracnosis es una enfermedad fúngica que causa graves pérdidas en el cultivo
de tomate de árbol en el Ecuador. La enfermedad causa graves daño en los frutos
y su control se basa principalmente en la utilización de productos químicos. A
nivel del Ecuador se ha reportado como causantes de la antracnosis a los
géneros Colletotrichum acutatum y Colletotrichum gloeosporioides en base a
características morfológicas. En el presente estudio se realizó la
caracterización morfológica y molecular de 16 aislados de Colletotrichum spp. de tomate de árbol, en seis localidades
diferentes en las provincias de Azuay y Loja. La caracterización morfológica se
la hizo para variables tales como color de la colonia y forma del conidio,
mientras que la caracterización molecular se realizó mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se realizó con primers específicos reportados
para C. acutatum y C. gloeosporioides, diseñados en el
espaciador de transcripción interna (ITS). En base a la caracterización morfológica
y molecular se determinó que el agente causal de la antracnosis para las
provincias de Azuay y Loja es el complejo de C. acutatum, representado por
C. tamarilloi. Los aislados presentaron las características propias de la
especie y los análisis moleculares permitieron confirmar este resultado,
generando amplificaciones de pesos moleculares de aproximadamente 500 pb, mientras
que con los primers específicos de C.
gloeosporioides no se obtuvo ninguna amplificación. Esta caracterización
molecular confirma los resultados que ubican al complejo de C. acutatum como agente causal de la
antracnosis en el Austro del Ecuador.
Palabras
clave: Internal transcribed spacer,
ojo de pollo, caracterización molecular, caracterización morfológica.
ABSTRACT
Anthracnose is a
fungal disease that causes serious losses in tree tomatoes in Ecuador. This
disease causes serious damage to fruits and its control is based mainly on use
of chemical products. In Ecuador, the genera Colletotrichum acutatum and Colletotrichum gloeosporioides
have been reported to be the causal agent of anthracnose, based on
morphological characteristics. In this study, the morphological and molecular
characterization of 16 isolates of Colletotrichum spp. of tree tomato, in six different
localities in the provinces of Azuay and Loja. Morphological characterization
was carried out for variables such as colony color and conidium shape, while
molecular characterization was performed by polymerase chain reaction (PCR).
PCR experiments was carried out with specific primers reported for C. acutatum
and C. gloeosporioides,
designed in the internal transcription spacer (ITS). Based on morphological and
molecular characterization, it was determined that the causative agent of
anthracnose for the provinces of Azuay and Loja is the C. acutatum complex, represented by C. tamarilloi.
Isolates presented characteristics of this species and molecular analysis
allowed to confirm this result, generating amplifications of molecular weights
of approximately 500 bp, while with the specific
primers of C. gloeosporioides
no amplification was obtained. This molecular characterization confirms results
that place the C. acutatum
complex as the causative agent of anthracnose in the Southern region of Ecuador.
Keywords: Internal transcribed spacer, chicken eye,
tree tomato, molecular characterization, morphological characterization.
INTRODUCCIÓN
El tomate de
árbol, Solanum betaceum Cav., es una
fruta andina con amplias perspectivas de desarrollo y cuya caracterización
morfológica y molecular ha situado a Ecuador como uno de los centros de
diversidad El cultivo tiene un gran potencial para su comercialización por sus
excelentes características organolépticas (Acosta-Quezada et al., 2011). Sin embargo, entre los numerosos problemas
fitosanitarios del cultivo tenemos la antracnosis de los frutos causado por el
hongo Colletotrichum spp, el cual
está ampliamente distribuida en las zonas productoras de tomate de árbol (Lobo et al., 2011).
Los síntomas
de esta enfermedad pueden presentarse en los frutos, tallos y ramas en sus
diferentes estados fenológicos de desarrollo. La mayor incidencia de la
enfermedad se presenta en épocas lluviosas y con temperaturas promedio entre 13
a 15oC y una humedad ambiental del 95%. Las lesiones se presentan de
color oscuro y varían en tamaño y forma. En los frutos las lesiones son negras,
deprimidas y acompañadas de masas de conidios de color rosa (Falconí et al., 2013). En Ecuador, las pérdidas
en el rendimiento debido a la antracnosis pueden variar en un rango comprendido
entre 60 y 80% (Santillán, 2001). Los métodos de control que se utilizan
actualmente comprenden la aplicación de agroquímicos, remoción de frutos
enfermos y control cultural (Lobo et al.,
2011).
La
identificación de especies de Colletotrichum
se ha basado principalmente en la morfología y el rango de huéspedes (Cannon et al., 2012). Sin embargo, estas
características son a menudo poco confiables para determinar adecuadamente la
especie a la que corresponde un aislado (Sreenivasaprasad et al., 1996). Como ejemplo, dentro del género Colletotrichum, la especie C.
acutatum puede ser o no patógena (Sreenivasaprasad y Talhinhas, 2005), mientras que C. acutatum, C. asianum, C. boninense, C. tamarilloi y C. theobromicola no son
específicos y pueden crecer en diferentes huéspedes (Cabrera et al., 2018).
A nivel
morfológico algunos estudios realizados han señalado a C. acutatum como el hongo responsable de la antracnosis en Ecuador (Viera
et al., 2016) y Colombia
(Afanador-Kafuri et al., 2003;
Saldarriaga et al., 2008;). Sin
embargo, otros estudios señalan a C.
gloeosporioides como el agente causal de la antracnosis en Ecuador y
Colombia (Rueda et al., 2005; Alarcón
y Chavarriaga, 2007; Lobo et al., 2011;
Obando 2012; Santander et al., 2014; Feicán
et al. 2016).
A nivel
molecular, estudios basados en la secuencia de la región espaciador transcrito
interno (ITS) del ADN ribosómico (ADNr) en Colombia mostraron que la
antracnosis en tomate de árbol es causada por C. acutatum y no por C.
gloeosporioides (Afanador-Kafuri et al.,
2003). Sin embargo, Pardo et al. (2016)
demostraron por marcadores moleculares definidos en el ITS y el gen glyceraldehyde
3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), que las especies de los grupos C. acutatum, C. boninense y C. gloeosporioides están asociados a cultivos de
tomate de árbol y mango.
En Ecuador,
los estudios de Falconí et al. (2013)
a nivel morfológico y molecular señalan como responsable a C. acutatum, en un estudio realizado en tres provincias del Ecuador
(Pichincha, Cotopaxi e Imbabura). Caicedo et
al., (2017) realizaron un estudio en la Región Interandina y señalan como
responsable a C. tamarilloi, especie
que ha sido definida dentro del complejo de C.
acutatum, pero su estudio solo incluyó tres muestras de las provincias de
Azuay y Loja. El objetivo del presente estudio fue confirmar al complejo C. acutatum como el agente causal de la
antracnosis en 16 localidades frutícolas de tomate de árbol en las provincias
de Azuay y Loja, a partir de características morfológicas y moleculares
(secuencia de ITS).
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección y aislamiento de Colletotrichum
La colecta de muestras se realizó en 16 zonas
frutícolas de tomate de árbol, en las provincias de Azuay (12 muestras) y Loja (4
muestras) durante el año 2016, en huertos que presentaron síntomas comunes de
antracnosis como lesiones negras en los frutos, acompañados de masas de
conidios de coloración rosada (Fig. 1). Se tomaron muestras de frutos y se
asignó un código a cada muestra (Tabla 1). Los frutos infectados se cortaron en
trozos de 5 mm con un bisturí estéril alrededor de lesiones jóvenes pequeñas
(2,5 mm de lesión y 2,5 mm de tejido sano). Los pedazos de tejido fueron esterilizados superficialmente con hipoclorito
de sodio al 3% durante 1,5 minutos y luego fueron enjuagados por tres ocasiones
con agua estéril. Se retiraron los bordes de cada pedazo para obtener porciones
más pequeñas. Luego fueron sembrada en caja de Petri con medio de cultivo PDA (Potato
Dextrose Agar TM MEDIA 344). Los aislados que crecieron, se purificaron con
subcultivos en cajas Petri. Se realizaron cultivos monospóricos de cada
aislado, utilizando la metodología de Nelson et al. (1983).
Figura 1. Lesiones
comunes de antracnosis observadas en frutos de tomate de árbol. Las muestras
fueron recolectadas en El Pan (provincia de Azuay).
Tabla 1. Códigos y ubicación de los aislados de Colletotrichum spp. recolectados en las
provincias de Azuay y Loja.
|
Código |
Localización (Sector-Provincia) |
Tejido afectado |
Coordenadas UTM |
|
UC001 |
Bulán,
Azuay |
Frutos,
hojas |
668643
- 9627984 |
|
UC002 |
Bulan,
Azuay |
Frutos,
hojas |
669668
- 9628959 |
|
UC003 |
Bulan,
Azuay |
Frutos,
hojas |
669848
- 9630259 |
|
UC004 |
El
Pan, Azuay |
Frutos,
hojas |
670393
- 9629800 |
|
UC005 |
El
Pan, Azuay |
Frutos,
hojas |
668675
- 9627293 |
|
UC006 |
El
Pan, Azuay |
Frutos,
hojas |
670091
- 9628676 |
|
UC007 |
Donjulo,
Azuay |
Frutos,
hojas |
670648
- 9628863 |
|
UC008 |
Donjulo,
Azuay |
Frutos,
hojas |
670548
- 9627837 |
|
UC012 |
Donjulo,
Azuay |
Frutos,
hojas |
673363
- 9628443 |
|
UC013 |
Donjulo,
Azuay |
Frutos,
hojas |
677929
- 9626685 |
|
UC013b |
Sevilla
de oro, Azuay |
Frutos,
tallos |
753442
- 9710649 |
|
UC014 |
Gauchapala,
Azuay |
Frutos,
hojas |
750130 - 9686580 |
|
UCO15b |
San
Pablo de Tenta, Loja |
Frutos,
tallos |
719491
- 9676999 |
|
UC016 |
San
Pablo de Tenta, Loja |
Frutos,
hojas |
689660
- 9601679 |
|
UC019 |
Saraguro,
Loja |
Frutos,
hojas |
686689
- 9599501 |
|
UC022 |
Las
Lagunas, Loja |
Frutos,
tallos |
695742
- 9597566 |
Caracterización morfológica
Para cada
aislado obtenido de los cultivos monospóricos se tomó asépticamente
secciones de 4 mm en las áreas de esporulación activa cerca del borde de
crecimiento y se sembró en cajas
Petri con medio PDA (cuatro repeticiones). Los aislados fueron incubados en
cámara de clima constante MEMMERT a ± 25 °C y ±75% de humedad relativa durante
7 días. La caracterización del micelio se realizó mediante observación directa
de cada aislado y se registró el tipo de micelio, la presencia, ausencia y el
tipo (escaso o algodonoso), coloración de la colonia y se realizaron mediciones
diarias para determinar la tasa de crecimiento hasta los 10 días luego de la
siembra en mm por día; de acuerdo a la metodología de Nelson et al. (1983) modificada.
Caracterización
de conidios
Para la
producción de conidios, los aislados se sembraron en medio de cultivo PDA y para
favorecer la esporulación se colocaron los aislados a los 5 días de siembra
bajo un fotoperiodo de 8 h con luz fluorescente (tubo General Electric
Staybright XL, F40SXL SP35 40 W). Se tomó una sección de cada aislado, se colocó
en un portaobjetos cuadriculado con una gota de lactofenol y se observó en un
microscopio óptico Olympus Bx 41 la forma de 10 conidios por caja (40 en total).
Las estructuras en cada placa se fotografiaron con cámara digital (Canon
Powershot ELPH 500 HS) adaptada al lente del microscopio Los conidios se
clasificaron según su forma en tres categorías, 0= conidios con los dos
extremos redondeados, 1= conidios con un extremo redondeado y otro agudo
(mixtas), 2= conidios con los dos extremos agudos.
Pruebas de patogenicidad
La
patogenicidad de los aislamientos obtenidos se verificó en frutos de tomate de
árbol. Los frutos se obtuvieron en estado de madurez fisiológica, y se
esterilizaron superficialmente mediante inmersión en etanol (tres minutos),
hipoclorito de sodio al 1 % (cinco minutos), y agua destilada estéril (tres
veces durante dos minutos cada vez). A continuación, se secaron en cámara de
flujo laminar. Los frutos se inocularon mediante el método de inoculación por
herida y goteo depositando 6 μL de la suspensión conidial (~ 1 × 106
esporas mL-1) sobre el área de la herida previamente demarcada (Than et al., 2008). Como control, se inoculó
agua destilada estéril. Los frutos inoculados se colocaron en cámaras húmedas
en condiciones estériles (humedad relativa cercana al 95 %) (Montri et al., 2009), a temperatura ambiente (±24ºC),
y sometidos a regímenes normales de luz durante siete días (Than et al., 2008). Por cada interacción
entre aislamiento y hospedante se emplearon tres repeticiones. Siete días
después de la inoculación se evaluaron los síntomas de la enfermedad y se
tomaron fragmentos del borde de las lesiones o del área inoculada (en caso de
no observar síntomas). El organismo aislado se cultivó en medio PDA y los
caracteres de la colonia y su morfología se compararon con el cultivo
inicialmente inoculado.
Caracterización molecular
El ADN se
extrajo del micelio del hongo obtenido de cultivos puros en medio PDA. Para
cada aislado se utilizó aproximadamente 100 mg de micelio de acuerdo a la
metodología de Fulton et al (1995).
La concentración del ADN para cada aislado se midió en un espectofotómetro (EPOCH)
y se diluyó hasta una concentración final de 50 ng/µl para la amplificación por
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se realizó con los primers
específicos de cada taxón: para C.
acutatum se utilizó el primer ITS4 (White et al., 1990) con el primer específico CaInt2 (GGGGAAGCCTCTCGCGG)
(Brown et al., 1996, Sreenivasaprasad
et al., 1996). Para C. gloeosporioides se utilizó el primer
ITS4 (White et al., 1990) con el primer
específico (CgInt) (GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG) (Brown et al., 1996). Las reacciones de PCR se realizaron en un
termociclador Eppendorf Mastercycler NexusGSX1, en un volumen final de 25 µl, con
50 ng de ADN, 2,5 mM de dNTP (cada uno), 0,25 mM de cada primer, 25 mM de MgCl2,
y 1 U de ADN polimerasa (Invitrogen). Las reacciones de PCR se realizarán
durante 30 ciclos (30 s a 95 ° C, 30 s a 60 ° C y 1,5 min a 72 ° C). Los
productos de la amplificación se separaron en geles de agarosa al 1% a 100 V
durante 30 minutos. Un marcador molecular de 1 kpb (Invitrogen) se utilizó como
estándar molecular.
RESULTADOS
Recolección y aislamiento del hongo
Se
obtuvieron 16 aislados monospóricos de Colletotrichum
spp., tomados de huertos de tomate de árbol en las provincias de Azuay y Loja.
Los aislados causaron síntomas típicos de antracnosis en los frutos de tomate
de árbol inoculados. En base a los síntomas se aisló nuevamente el patógeno y
sus características morfológicas resultaron similares al originalmente
inoculado, con lo que se cumplieron los postulados de Koch.
Caracterización morfológica
Características
de la colonia
Los aislados en medio PDA presentaron diferente
morfología en cuanto al color. En general el color de la colonia de los
aislados cambió de tonalidades claras a oscuras con el paso de los días. Se
observó colores que van desde blanco a amarillo en la superficie superior, y
desde naranja a violeta en la inferior (Figura 2). Estas coloraciones de
tonalidades claras son asociadas con C.
acutatum y para la mayoría de aislados la morfología de la colonia
(superficie superior e inferior) fue consistente con descripciones publicadas
para las especies del complejo C.
acutatum. (Than et al., 2008; Falconí
et al., 2013; Caicedo et al., 2017). El crecimiento de los
diferentes aislados fue regular y progresivo en medio PDA y después de 10 días
a ± 25°C, la caja Petri estuvo casi completamente recubierta por los aislados. Siete
de los 16 aislados presentaron un micelio algodonoso y denso en el centro,
mientras el resto presentaron un micelio escaso. Se registró la formación de
micelio aéreo de tipo escaso-liso en un 60% de las colonias y 40% de tipo
abundante- algodonoso (Tabla 2, Figura 2).
Tabla 2. Caracterización morfológica y tipo de conidios de aislados
de Colletotrichum spp. de tomate de
árbol en las provincias de Azuay y Loja.
|
Código |
Crecimiento |
Tipo de micelio |
Coloración superficie inferior |
Coloración superficie inferior |
Forma Conidios |
|
UC001 |
4,90 RL |
Escaso |
Blanco |
Amarillo |
2 |
|
UC002 |
5,21 RL |
Algodonoso |
Crema |
Marrón |
1 |
|
UC003 |
4,88 RL |
Escaso |
Crema |
Marrón |
2 |
|
UC004 |
5,15 RL |
Escaso |
Crema |
Marrón |
1 |
|
UC005 |
5,05 RL |
Algodonoso |
Crema |
Marrón |
2 |
|
UC006 |
5,21 RL |
Escaso |
Crema |
Violeta |
1 |
|
UC007 |
7,00 ML |
Escaso |
Amarillo |
Marrón |
1 |
|
UC008 |
6,30 RL |
Algodonoso |
Crema |
Marrón |
2 |
|
UC012 |
7,48 R |
Algodonoso |
Blanco |
Marrón |
2 |
|
UC013 |
8,50 R |
Algodonoso |
Crema |
Naranja |
2 |
|
UC013b |
8,00 R |
Algodonoso |
Crema |
Violeta |
1 |
|
UC014 |
4,80 RL |
Escaso |
Crema |
Naranja |
2 |
|
UCO15 |
5,94 RL |
Escaso |
Crema |
Naranja |
2 |
|
UC016 |
9,00 R |
Escaso |
Blanco |
Violeta |
1 |
|
UC019 |
6,65 RL |
Algodonoso |
Blanco |
Marrón |
2 |
|
UC022 |
7,55 R |
Escaso |
Blanco |
Marrón |
2 |
R = rápido,
ML = moderadamente lento, RL = relativamente lento
0= conidios con los dos extremos redondeados, 1=
conidios con un extremo redondeado y otro agudo (mixto), 2 = conidios con dos
extremos agudos
Índice
de crecimiento
Los 16 aislados de Colletotrichum
spp. presentaron, crecimiento regular y
uniforme. El 60% de las colonias presentaron crecimiento relativamente lento
(< 7cm de diámetro después de 10 días), el 30% presentaron crecimiento
rápido (> 7cm de diámetro después de 10 días) y el 10 % crecimiento
moderadamente lento (Tabla 2). No hubo diferencia significativa entre la tasa
de crecimiento de los aislados (P = 0·1807).
Figura 2. Variabilidad
morfológica de colonias de aislados del complejo Colletotrichum spp de tomate de árbol en las provincias de Azuay y Loja.
Para cada aislado se muestra las superficies superior e inferior de la colonia
a los 10 días a ± 25°C y ±75% de humedad relativa, en medio de cultivo PDA.
Morfología
de los conidios
Se encontraron dos tipos de conidios en los
aislados. El primer tipo correspondió a conidios que presentaban dos extremos
agudos, en especial los aislados de Donjulo y el cantón Saraguro (60 % de los
aislados). El segundo tipo correspondió a conidios con un extremo redondeado y
un extremo agudo (40 % de los aislados). Se ha reportado este tipo de conidios
correspondientes al tipo C. acutatum (Oliveira et al., 2005). No se diferenciaron conidios con ambos extremos
redondeados que corresponden con el tipo de C.
gloeosporioides.
Figura 3. Variabilidad
morfológica de conidios de aislados del complejo Colletotrichum spp de tomate de árbol en las provincias de Azuay y Loja a
los 10 días a ± 25°C y 75% de humedad relativa, en medio de cultivo PDA. Todas
las barras de escala representan 10 μm.
Pruebas de
patogenicidad
La patogenicidad de los aislados de Colletotricum spp. en frutos
de tomate de árbol por el método de inoculación por herida y goteo mostró
síntomas de antracnosis y lesiones que no fueron diferentes en tamaño entre
ellas. Las lesiones presentadas fueron
típicas de huéspedes susceptibles. Las lesiones aparecieron a partir del cuarto
día de inoculación Para todos los aislados se produjo en los frutos infectados lesiones
deprimidas y el desarrollo de micelio de color rosáceo, característico de C. acutatum (Figura 4).
Figura 4. Reacción
en frutos de tomate de árbol inoculados artificialmente con aislados de Colletotrichum acutatum por el método de
herida goteo con suspensión de esporas, después de 7 días a ±24ºC.
Análisis moleculares
El ADN de 16
aislados de Colletotrichum colectados de tomate de árbol fueron probados con
los primers específicos para C. acutatum
(CaInt2) y C. gloeosporioides
(CgInt). Las reacciones de PCR para aislados representativos se muestran en la
figura 5. Un fragmento de ADN de aproximadamente 490-bp fue amplificado con los
primers específicos CaInt2 y ITS4 para C. acutatum. Los primers de de acuerdo al Centro
Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) pueden amplificar tanto C.
acutatum como C. tamarilloi. No se
obtuvo ninguna amplificación del ADN de los aislados colectadas al utilizar los
primers ITS4-Cngt, específicos de C.
gloeosporioides (resultados no mostrados). En el presente caso se ha
determinado por un método molecular (PCR) la presencia de C. tamarilloi,
perteneciente al complejo acutatum en tomate de árbol.
Figura. 5. Identificación
específica de C. acutatum, con el primer
CaInt2 en combinación con el primer diseñado en la secuencia ITS. M: Marcador
de Peso Molecular; líneas 1,2,3, 4 y 5: muestras de Azuay; líneas 6, 7 y 8:
muestras de Loja; C: control.
DISCUSIÓN
El presente
estudio fue llevado a cabo para clarificar cuál es el agente causal de la
antracnosis en tomate de árbol en las provincias de Loja y Azuay, en base a
características morfológicas, moleculares y patogénicas. Se determinó que el
hongo responsable pertenece al complejo de C.
acutatum. Las pruebas de patogenicidad en frutos inoculados por herida mostraron
que todos los aislados fueron patógenos para el tomate de árbol.
Anteriormente
la clasificación taxonómica de la especie responsable de la antracnosis se
basaba principalmente en el tamaño del conidio y la forma (Cannon et al., 2012). Otras especies del género
Colletotrichum han sido reportadas
como agente causal de la antracnosis en tomate de árbol incluyendo C. gloeosporioides. Sin embargo, los
síntomas observados en el campo durante la colecta coincidieron con la
descripción de la enfermedad dada por Falconí et al. (2013) y Caicedo et al.
(2017), quienes señalan como responsable al hongo C. acutatum y C. tamarilloi
(complejo acutatum), y señalan síntomas
como lesiones negras en forma de depresión en los frutos, acompañadas de lesiones con masas
de esporas de color rosado.
La caracterización morfológica mostró que el 62,5% de los aislados evaluados en el presente estudio fueron
de color crema, 31,25 % blanco y
6,25% amarillo en
la parte superior y de color naranja a violeta en el reverso de las cajas. La morfología de la colonia para todos los aislados
(superficies superior e inferior) coinciden con las descripciones publicadas
para las especies del complejo C.
acutatum (Than et al., 2008, Falconí
et al., 2013, Caicedo et al., 2017). La variación del color obtenida
en el presente estudio podría indicar una alta variabilidad que podría ser
explicada por la preferencia del huésped por parte de la especie o por aislado
geográfico (Nirenberg et al., 2002). En las inoculaciones
sobre frutos llevadas a cabo en el laboratorio, en general el color de las colonias cambió con el
tiempo de blanco a oscuro, pero el color del micelio fue rosado, lo cual es
característico de C. acutatum (Than et al., 2008; Falconí et al., 2013, Caicedo et al., 2017).
La tasa de crecimiento de la colonia in vitro fue otra característica importante para determinar
que el hongo responsable pertenece al complejo acutatum. En nuestro estudio la mayor parte de las colonias
tuvieron un crecimiento lento, lo cual concuerda con lo publicado por Than et al (2008). En el mismo estudio se señala que la tasa de crecimiento para C. gloeosporioides es más elevada. Esta característica era utilizada
también para diferenciar las dos especies. En cuanto a los conidios, resulta
muy difícil diferenciar morfológicamente C.
gloeosporioides y C. acutatum debido a la gran variabilidad
en las características de colonia y conidios (Bridge et al., 2008; Cannon et al., 2012). Se ha sugerido que
las variaciones morfológicas y tamaño de conidios puede estar relacionado a
componentes fisiológicos tales como exposición al sol, temperatura y otras
variables (Crouch et al., 2006). Afanador-Kafuri et al. (2003) y Falconí et al (2013), usaron la forma de los
conidios conjuntamente con datos moleculares para establecer a C. acutatum como responsable de la antracnosis en tomate de
árbol. En nuestro trabajo encontramos conidios de bordes redondeados y agudos,
cuyo tamaño fue consistente con los reportados por Afanador-Kafuri et al. (2003), Damm et al. (2012) y (Oliveira et al 2005) para C. acutatum, mientras
que conidios cilíndricos han sido
asociados con C. gloeosporioides
(Sutton, 1992).
El uso exclusivo de características
morfológicas para identificar diferencias entre poblaciones de Colletotrichum ha
demostrado ser poco confiable (Sreenivasaprasad y Talhinhas, 2005) .Además distinguir los taxones de Colletotrichum en general es difícil debido a la falta de
protocolos estandarizados y normas internacionales y, por lo tanto, las
relaciones taxonómicas dentro del género son poco probables que se resuelven
sólo por el uso de caracteres morfológicos tradicionales (Falconí et al., 2013).Las especies de Colletotrichum, son
muy difíciles de describir sin ambigüedades debido a su amplia variabilidad
morfológica y molecular y la
morfología de los conidios puede ser afectada por diferencias en condiciones
artificiales pero la identificación directa de aislados procedentes de la
planta es también difícil porque la morfología de los conidios varía durante el
proceso de infección (Pardo et al., 2016; Falconí et al.,
2013). Así, es necesario apoyarse en el análisis molecular para la
determinación de la especie.
Numerosos estudios han
reportado subgrupos dentro de complejo de especies de C. acutatum. Los análisis moleculares son capaces de resolver
estos complejos de especies y actualmente la clasificación puede hacerse utilizando
hasta ocho locus diferentes (Cannon et al., 2012). Análisis moleculares en
multilocus incluyendo los genes ITS, ACT, TUB2, CHS-1, GAPDH y
HIS3, han ayudado a definir el clado
como un colectivo con 29 especies estrechamente relacionadas, incluido C. tamarilloi (Damm et al., 2012; Cannon et al., 2012). Caicedo et al.
(2017) demostraron mediante análisis moleculares en multilocus la presencia de C. tamarilloi, perteneciente al complejo
C. acutatum en el callejón
Interandino, incluyendo el sur del Ecuador. No obstante, el estudio de Caicedo et al. (2017) comprendió solamente tres
muestras, dos en Azuay (Paute) y una en Loja (El Valle). En el presente estudio
utilizamos 16 aislados y con el uso de primers específicos confirmamos la
identificación del complejo C. acutatum
como el agente causal de la antracnosis en tomate de árbol, en las provincias
del Azuay y Loja.
CONCLUSIONES
El estudio permitió
confirmar a nivel morfológico y molecular que el complejo C. acutatum es el agente causal de la antracnosis u ojo de pollo en
el cultivo de tomate de árbol para las provincias de Azuay y Loja. El presente estudio
servirá de base para generar nuevos estudios sobre la variabilidad del hongo y
para generar alternativas de manejo y control integrado de esta enfermedad en
plantaciones de tomate de árbol.
AGRADECIMIENTOS
Los autores
expresan su agradecimiento especial a Rosa Delgado por su ayuda en el test de
repique de aislados e inoculación de frutos con el micelio del hongo. El
presente trabajo fue financiado por la Dirección de Investigaciones de la
Universidad de Cuenca (DIUC) y el Instituto Nacional de Investigaciones
Agropecuarias (INIAP).
CONTRIBUCIÓN DE AUTORES
Las
contribuciones de los autores para el estudio: “Caracterización morfológica y molecular del agente causal de la
antracnosis en tomate de árbol en Azuay y Loja”.
Castro-Quezada
Patricio y Bravo-Zuñiga, Catalina contribuyeron de igual manera en este
trabajo.
Castro-Quezada,
P.; Bravo-Zuñiga, C.; y Díaz-Granda; L.: diseño y desarrollo del proyecto, actuaron
en todas las etapas de la investigación;
Norma Quillay-Curay: trabajo de
laboratorio, sistematización de datos;
Cabrera-
Cabrera A.: trabajo de laboratorio, pruebas de patogenicidad;
Ramón-
Montoya, M; Belesaca-Morocho, I: colectas y caracterización en campo.
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