e-ISSN: 1390-5902
CEDAMAZ Revista del Centro de Estudio y Desarrollo de la Amazonia , Vol. 11, No. 1, pp. 1–5, enero–junio 2021
Control de la oxidación fenólica de segmentos nodales de Handroanthus
heptaphyllus en condiciones in vitro
Control of phenolic oxidation of Handroanthus heptaphyllus nodal segments under in
vitro conditions
Díaz-Lezcano Maura Isabel
1,*
, Rodas-Ramirez Javier María
1
, Gonzalez-Segnana Luis Roberto
1
y
Vera de Ortiz Mirtha
1
1
Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Asunción, Campus de San Lorenzo, Paraguay
*
Autor para correspondencia: maura.diaz@agr.una.py
Fecha de recepción del manuscrito: 03/02/2021 Fecha de aceptación del manuscrito: 30/06/2021 Fecha de publicación: 15/07/2021
Resumen—El cultivo in vitro podría constituirse en una opción viable en la producción masiva de Handroanthus heptaphyllus (Vell.)
Mattos (lapacho de flores blancas), especie forestal nativa en Paraguay, de la familia de las Bignoniaceae, poseedora de una característica
singular atribuible a sus inflorescencias blancas, las cuales se observan en pocos ejemplares del género. El objetivo del presente trabajo fue
establecer un protocolo para el control de la oxidación fenólica in vitro de segmentos nodales de Handroanthus heptaphyllus, mediante el
uso de carbón activado en distintas concentraciones (1, 2, 3 y 4 g.L
−1
) en medio de cultivo de Murashige y Skoog. Fueron utilizados 40
segmentos nodales provenientes de plantas madres mantenidas en vivero. Se realizó el tratamiento de las plantas madres con la aplicación
de mancozeb 3 g.L
−1
. Las variables medidas fueron oxidación y sobrevivencia hasta los 35 días de incubación. Se efectuó análisis de
varianza y test de Tukey con un nivel de confianza del 5%. Los análisis estadísticos demostraron diferencias significativas en el control de
la oxidación, siendo la concentración de 3 g.L
−1
de carbón activado el tratamiento más efectivo.
Palabras clave—Explantes, Lapacho de flores blancas, Micropropagación, Plantas madres, Oxidación fenólica.
Abstract—In vitro culture could become a viable option in the mass production of Handroanthus heptaphyllus (Vell.) Mattos (white-
flowered lapacho), an indigenous species from Paraguay, from the family Bignoniaceae. This species possesses a unique characteristic due
to its white inflorescences, which are observed in a few specimens of the genus. The objective of the present work was to establish a protocol
for the control of in vitro oxidation of Handroanthus heptaphyllus nodal segments by using activated charcoal in different concentrations
(1, 2, 3 and 4 g.L
−1
) in Murashige and Skoog culture medium. A total of 40 nodal segments were used from parent plants that were kept
in the nursery. These parent plants were treated with the application of mancozeb at 3 g.L
−1
. The variables measured were oxidation and
survival up to 35 days of incubation. Analysis of variance and Tukey test were performed with a confidence level of 5%. Statistical analyses
showed significant differences in oxidation control. The 3 g.L
−1
concentration of activated charcoal has been the most effective.
Keywords—Explants, White-flowered lapacho, Micropropagation, Parent plants, Phenolic oxidation.
INTRODUCCIÓN
H
androanthus heptaphyllus (Mart.) Mattos es una espe-
cie arbórea de la familia Bignoniaceae, de alto valor
económico. Debido a su intensa floración es bastante común
su utilización en proyectos de paisajismo y arborización
urbana (Carvalho 2003). Es uno de los árboles más altos
del Paraguay, posee copa semi-globosa y poco densa, con
el follaje concentrado en un solo estrato hacia los extremos.
La inflorescencia es una panícula terminal con numerosas
flores vistosas de 5-8 cm de largo, tiene una corola tubular
de color rosado o rosado-morado, en forma de una campana
con cinco lóbulos redondeados desiguales, aunque algunos
individuos tienen flores blancas, y florece de mayo a julio
(López et al., 2002).
Si bien esta especie se propaga comúnmente por semilla,
tiene el inconveniente de que durante su almacenamiento
presenta variaciones en términos de calidad, teniendo un po-
der germinativo que rápidamente se ve reducido (Carvalho,
1994; Duarte et al., 2014). En este sentido, las semillas de
las especies del género Handroanthus tienen un período
relativamente corto de viabilidad natural, lo que representa
dificultades para establecer técnicas de cultivo orientadas a
la producción de plántulas (Cabral et al., 2003; Martins et
al., 2012). Ante estas limitaciones para la propagación de
1
CONTROL DE LA OXIDACIÓN FENÓLICA DÍAZ-LEZCANO et al.
Handroanthus, los métodos de cultivo in vitro constituyen
una vía alternativa con resultados satisfactorios en los
coeficientes de multiplicación y por las posibilidades de
éxito de las plantaciones forestales en campo. Los princi-
pales avances del cultivo in vitro de tejidos han permitido
la multiplicación de especies de interés forestal mediante
organogénesis y embriogénesis somática (Daquinta et al.,
2000; Barbón, 2011; Jiménez Terry Agramonte, 2013).
La micropropagación contribuye a mantener el equilibrio
del ecosistema forestal y del medio ambiente, ya que como
herramienta de rescate permite la producción de plantas y
la conservación de la biodiversidad genética, así como la
innovación de procedimientos tecnológicos en los bosques
tropicales (Farjon, 2003). En el cultivo de tejidos in vitro, la
oxidación constituye uno de los principales inconvenientes
en el proceso, y es causada principalmente por el efecto
abrasivo del agente desinfectante aplicado durante la asepsia
del explante, los cortes que sufre el explante, la composición
del medio de cultivo y el volumen y la calidad del frasco de
cultivo (Abdelwahd et al., 2008).
El resultado de este trabajo podría constituir un aporte para
el establecimiento de un protocolo para la micropropagación
del Handroanthus heptaphyllus, para su utilización con fines
ornamentales, de restauración forestal y/o para reforestación.
El objetivo de la presente investigación fue establecer un
protocolo para el control de la oxidación in vitro de segmen-
tos nodales de Handroanthus heptaphyllus mediante el uso
de carbón activado en diferentes concentraciones.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los ensayos se llevaron a cabo en el laboratorio de Bio-
tecnología del Departamento de Biología de la Facultad de
Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Asunción,
ubicada en el Campus de ciudad de San Lorenzo, Paraguay.
Se utilizaron 40 segmentos nodales provenientes de 50
plantas madres sanas de Handroanthus heptaphyllus las cua-
les fueron obtenidas por injerto, las mismas poseían una al-
tura promedio de 35 cm. El medio de cultivo utilizado como
base para el experimento fue la solución inorgánica desarro-
llada por Murashige Skoog (MS) suplementado con 1, 2, 3 y
4 g.L
−1
de Carbón Activado (CA). Para la inoculación in vi-
tro se procedió a la extracción de segmentos con dos yemas.
Para cada tratamiento se realizaron 10 réplicas.
Tratamiento de las plantas madres
Se realizó un ensayo preliminar de tratamientos de plan-
tas madres, con la comparación de 50 plantas tomadas co-
mo testigos y 50 con la aplicación de un fungicida. Las 50
plantas madres fueron tratadas con el fungicida Dithane M-
80 de composición mancozeb etileno bis de manganeso (di-
tiocarbamato) con una concentración de 3 g.L.
−1
aplicadas
por medio de un pulverizador manual. Las mismas estuvie-
ron instaladas en el vivero forestal de la Facultad de Ciencias
Agrarias, en la ciudad de San Lorenzo, Paraguay con coor-
denadas geográficas: 25º20´14,37” S y 57º30´53,37”.
Método de inoculación in vitro de segmentos nodales
Se utilizaron 40 segmentos nodales, los cuales fueron
sumergidos en frascos esterilizados que contenían alcohol
etílico al 70% durante un periodo de 3 minutos. Luego, fue-
ron sometidos a un tratamiento de desinfección, constituido
por una solución de hipoclorito de sodio al 10%, durante
un tiempo de 5 minutos, según protocolo de desinfección
de Díaz Lezcano et al. (2020). Posteriormente, fueron
realizados tres enjuagues con agua destilada estéril.
Una vez desinfectados los segmentos nodales fueron
sembrados en el medio de cultivo de Murashige Skoog,
suplementado con CA en concentraciones de 1 (T1), 2 (T2),
3 (T3) y 4 g.L.
−1
(T4), respectivamente.
Una vez realizada la siembra en la cámara de flujo lami-
nar, los explantes fueron llevados a la cámara de incubación
a una temperatura aproximada de 25 ºC y un fotoperiodo de
16 horas luz, proporcionada por tres fluorescentes de 20W, y
8 horas oscuridad, para finalmente evaluar la oxidación fenó-
lica de los explantes por un tiempo de 35 días.
Análisis estadístico
Se analizaron la oxidación fenólica y la sobrevivencia de
los explantes en función de la concentración de CA (cuatro
tratamientos). Los resultados obtenidos del experimento fue-
ron analizados mediante una ANOVA paramétrica con distri-
bución normal de los datos y homogeneidad de varianzas de
tipo unifactorial y las medias fueron comparadas con la prue-
ba de Tukey al nivel de 5% de probabilidad con la ayuda del
programa estadístico XLSTAT.
RESULTADOS
El tratamiento de las plantas madres con fungicida “Ditha-
ne M-80” a una concentración de 3 g.L
−1
se mostró efectivo,
resultando en el 45% de plantas libres de signos de hongos
fitopatógenos (Figura 1).
Fig. 1: Porcentaje de plantas madres de Handroanthus
heptaphyllus (Vell.) Mattos con signos de presencia de hongos con
y sin aplicación del fungicida.
Para el control de la oxidación fenólica, los segmentos no-
dales sembrados en el medio de cultivo del T3 (concentra-
ción de 3 g.L
−1
de CA) dieron el mejor resultado con 0% de
oxidación en los explantes al cabo de los 35 dias de experi-
mentación (Figura 2).
2
e-ISSN: 1390-5902
CEDAMAZ Revista del Centro de Estudio y Desarrollo de la Amazonia , Vol. 11, No. 1, pp. 1–5, enero–junio 2021
Fig. 2: Porcentaje de oxidación de explantes in vitro de
Handroanthus heptaphyllus (Vell.) Mattos, sometidos a los
diferentes tratamientos (T1-T4) con Carbón Activado (C.A.).
El análisis de varianza reportó diferencias significativas
(F = 9,00 p<0,05) en la proporción de explantes oxidados a
los 35 días para los tratamientos empleados. Como puede
apreciarse en la Tabla 1, el Test de Tukey revela que el
tratamiento T3 fue significativamente más efectivo para
controlar la oxidación que los tratamientos T2 y T4 (60% de
oxidación en ambos casos).
Tabla 1: Resultado del test de Tukey para la comparación de las
proporciones de explantes oxidados en función de los tratamientos
empleados en el control de la oxidación de Handroanthus
heptaphyllus. Letras diferentes indican diferencias significativas
con p<0,05.
Diferencia Mínima Significativa
(Test de Tukey al 5%) = 0,8167
Tratamiento Media
2 1,000 A
4 1,000 A
1 0,333 AB
3 0,000 B
Sobrevivencia
La sobrevivencia de explantes fue disminuyendo con el
tiempo, representando un máximo de 20% a los 35 días con
la aplicación de T3, siendo la contaminación la principal
causa de necrosis de los explantes representando 80%
(Figura 3).
Fig. 3: Porcentaje de oxidación, contaminación y sobrevivencia de
explantes in vitro de Handroanthus heptaphyllus (Vell.) Mattos a
los 35 días del cultivo.
La sobrevivencia fue evaluada mediante el análisis de va-
rianza, el cual no reportó diferencias significativas en los tra-
tamientos empleados.
DISCUSIÓN
El tratamiento de desinfección puede comenzar con
pre-tratamientos aplicados a la planta madre principalmente
para combatir microorganismos (Chagas et al., 2006), lo
cual significó un aporte importante en los ensayos previos al
control de oxidación de los explantes. Como pre-tratamiento,
Díaz Lezcano et al (2021) trataron plantas madre de Handro-
anthus heptahyllus con Oxicloruro de cobre (OxiCob®) y
Ditiocarbamato (Mancozeb®) en proporción de 3 y 2 g.L
−1
,
respectivamente, obteniendo el control de la ocurrencia de
hongos, coincidiendo con la presente investigación en donde
el tratamiento consistió en la aplicación de Mancozeb a una
concentración de 3 g.L
−1
.
El establecimiento in vitro de tejidos vegetales de algunas
especies de plantas, especialmente angiospermas leñosas,
está, en gran medida, limitado por la ocurrencia de oscure-
cimientos letales en los explantes y en el medio de cultivo
(Azofeifa, 2009), causadas por la liberación de pigmentos
por parte de las plantas, principalmente polifenoles y taninos
(Hernández y González, 2010). Teixeira (2006) menciona
que cuando se extrae un explante de la planta madre, la
primera respuesta del tejido es la oxidación de compuestos
fenólicos en el sitio de corte, que es lo que ocurrió en
el presente estudio. Los explantes con alto contenido de
polifenoles complican el cultivo in vitro, ya que la oxi-
dación fenólica de esta sustancia produce oscurecimiento
y eventual muerte de los explantes (Roca y Mroginski, 1991).
Esta oxidación pudo ser controlada en los ensayos con el
uso de carbón activado, de manera similar a lo obtenido por
Fiori Fernández et al. (2016) utilizando Medio Murashige
Skooge suplementado con 2 g.L
−1
de C.A., quienes afirman
que el uso de este antioxidante suprimió la oxidación en
explantes de Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd ex Mart.
También Zichner et al. (2012) obtuvieron buenos resultados
en la propagación clonal in vitro de segmentos nodales de
Eucalyptus grandis Hill ex Maiden, donde de manera similar
a este estudio, una concentración de 3 g.L
−1
de carbón
activado obtuvo los mejores resultados.
En cuanto a la sobrevivencia, la misma está referida a
la cantidad de segmentos nodales que presentaron callos,
brotes y a la vez segmentos indiferentes estos están relacio-
nados directamente con la cantidad de explantes oxidados
y contaminados. Puede decirse que cuando un inóculo con
potencialidad de diferenciación se incuba en condiciones
favorables regenera nuevos individuos (Villalobos y Thorpe
1993).
En cualquier caso, en el presente experimento encontra-
mos una elevada proporción de contaminación. Investigacio-
nes de Larraburu (2014) reportaron que la desinfección de
explantes de Handroanthus impetinginosus mediante lavado
bajo corriente de agua, tratamiento con NaClO y enjuagues
con agua estéril permitió la obtención de un bajo porcenta-
3
CONTROL DE LA OXIDACIÓN FENÓLICA DÍAZ-LEZCANO et al.
je de contaminación (5-10%). Por su parte Díaz Lezcano et
al. (2020) sostienen que el tratamiento con NaOCl comercial
al 10% en la desinfección de segmentos nodales de Handro-
anthus hepthaphyllus mostró los mayores porcentajes de pér-
didas por necrosis. Teniendo todo esto en cuenta, y con base
en el alto porcentaje de contaminación microbiana observa-
da en el presente estudio, se concluye que los tratamientos de
desinfección deben ser mejorados en futuras investigaciones.
CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES
Conceptualización, MD, JR y LG; metodología, MD, LG
y JR; análisis formal, MD, JR, LG y MV; investigación, MD,
JR y LG; recursos, MD, JR y LG; curación de datos, MD, JR
y MV;redacción y preparación del borrador original, MD y
JR; redacción, revisión y edición, MD.
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