e-ISSN: 1390-5902
CEDAMAZ Revista del Centro de Estudio y Desarrollo de la Amazonia , Vol. 11, No. 1, pp. 6–12, enero–junio 2021
Actividad antimicótica del aceite esencial de Plumbago scandens
L.(Plumbaginaceae)
Antifungal activity of the essential oil from Plumbago scandens L. (Plumbaginaceae)
Luis Alberto Morocho-Yaguana
1,*
, Anabel Marisol Carrión-Lliguín
1
, Grace del Pilar
Cambizaca-Mora
2
y Humberto Daniel Riascos-Jaramillo
1
1
Carrera de Laboratorio Clínico, Universidad Nacional de Loja. Loja, Ecuador
luis.morochoy@unl.edu.ec, annycarrion@outlook.com, humberto.riascos@unl.edu.ec.
2
Carrera de Enfermería, Universidad Técnica Particular de Loja. Loja, Ecuador
gdcambizaca@utpl.edu.ec
*
Autor para correspondencia: luis.morochoy@unl.edu.ec
Fecha de recepción del manuscrito: 28/04/2021 Fecha de aceptación del manuscrito: 12/07/2021 Fecha de publicación: 15/07/2021
Resumen—Los hongos son organismos eucariotas, heterótrofos, carentes de clorofila, causantes de infecciones en los seres humanos
cuando ingresan por vía respiratoria, inoculación, pinchazos o contacto físico. La incidencia de las infecciones fúngicas oportunistas está
en aumento, debido al incremento de la población inmunocomprometida, el turismo y la falla terapéutica. En el presente estudio se planteó
evaluar la actividad antimicótica del aceite esencial de las partes aéreas de Plumbago scandens L. extraído por arrastre de vapor y purificado
por cromatografía de columna contra cepas de hongos de la American Type Culture Collection (ATCC). La actividad antimicótica se evaluó
mediante la técnica de Kirby Bauer modificada; para ello se prepararon tres diluciones en acetona, en concentraciones de 50, 25 y 12,5
µg/mL, con 10 µL de estas soluciones se impregnaron discos de papel Whatman Nº 3, de 6 mm de diámetro, con un contenido de 0,5 µg, 0,25
µg y 0,125 µg/disco. Como controles positivo y negativo se usó nistatina y acetona respectivamente. La actividad antimicótica se evaluó
midiendo el diámetro en mm de los halos de inhibición alrededor del disco de papel. El aceite esencial presentó actividad antimicótica
contra Candida albicans(ATCC 26790), Cryptococcus neoformans (ATCC 14116), Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404) y Trichophytum
rubrum (ATCC 28188) en todas las concentraciones, excepto Candida albicans a la concentración de 0,125 µg/disco.
Palabras clave—Actividad antimicótica, Aceite esencial, Plumbago scandens, Método Kirby Bauer.
Abstract—Fungi are eukaryotic, heterotrophic, chlorophyll-free organisms that cause infections in humans when they enter by air, ino-
culation, punctures or physical contact. The incidence of opportunistic fungal infections is increasing due to the increase in the immuno-
compromised population, tourism, and therapeutic failure. The present study considered evaluating the antifungal activity of the essential
oil of the aerial parts of Plumbago scandens L. extracted by steam entrainment and purified by column chromatography against fungal
strains of the American Type Culture Collection (ATCC). The antifungal activity was evaluated by the modified Kirby Bauer technique. For
this, three dilutions in acetone were prepared in concentrations of 50, 25 and 12.5 µg/mL. With 10 µL of these solutions, Whatman No. 3
paper discs of 6 mm diameter were impregnated, containing 0.5 µg, 0.25 µg and 0.125 µg/disc. As positive and negative controls, nystatin
and acetone were used respectively. Antifungal activity was evaluated by measuring the diameter in mm of the inhibition halos around
the paper disk. The essential oil showed antifungal activity against Candida albicans (ATCC 26790), Cryptococcus neoformans (ATCC
14116), Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404) and Trichophytum rubrum (ATCC 28188) at all the concentrations; only Candida albicans,
at a concentration of 0.125 µg/disc did not show sensitivity.
Keywords—Antifungal activity, Essential oil, Plumbago scandens, Kirby Bauer method.
INTRODUCCIÓN
L
os hongos son organismos eucariontes, heterótrofos,
carentes de clorofila, que tienen nutrición absortiva,
caracterizados por la formación de hifas, estructuras filamen-
tosas formadas por células intercomunicadas denominadas
micelio (Ocara et al., 2019). Se presentan en todos los
ambientes y superficies: se les puede encontrar en suelo,
agua, aire, sobre la superficie de objetos inanimados, en el
ambiente cerrado de casa, hospitales, edificios e, incluso,
colonizando animales y al propio ser humano, por lo que
están íntimamente ligados a la historia y desarrollo del hom-
bre, pues este los usa como fuente de alimentos y sustancias
activas de medicamentos, y su capacidad enzimática es
ampliamente usada en la industria y la silvicultura (Janbon
et al., 2019).
6
ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA DEL ACEITE ESENCIAL DE PLUMBAGO SCANDEN MOROCHO-YAGUANA et al.
Los hongos son los causantes de muchas enfermedades
infecciosas, tanto en hombre como animales y plantas
(Ocara et al., 2019). En la biosfera desempeñan una función
importante al permitir el desdoblamiento de la materia
orgánica, contribuyendo de esta manera a completar el ciclo
de la materia y energía (Guarro, 2012).
Los hongos producen infecciones superficiales y muco-
cutáneas leves, con tendencia a la cronicidad en personas
inmunocompetentes. Las especies oportunistas solo causan
enfermedad a las personas inmunocomprometidas, por
lo que existe un gran interés en aquellas enfermedades
causadas por hongos y que afectan a este tipo de pacientes
(Valderrama et al., 2018). Se estima que más de 300 millones
de personas de todas las edades sufren de una infección
fúngica grave cada año en todo el mundo, de las cuales, más
de 1,66 millones mueren por dicha causa, número que supera
a las causadas por malaria, SIDA y tuberculosis (Herrera
Gancino, 2017).
Para el tratamiento de las micosis se cuenta con varios
fármacos de usos tópico y sistémico, principalmente el grupo
de los azoles, ciclopiroxolamina (piridonas), tiocarbamatos,
benzofuranos, alilaminas y morolfinas (Conejo Fernández et
al., 2016), pero estos pueden tener una actividad antifúngica
limitada o pueden no ser seguros en la administración sisté-
mica (Sepahvand. A , Ezatpour. B., F.Tarkhan , Mahmoud
Bahmani Razi, 2017), a lo que se suma el surgimiento de
cepas resistentes. Todo ello se ha traducido en un incremento
en la búsqueda de nuevos agentes antifúngicos de origen
natural, enfocada en la variedad de metabolitos secundarios
(Soo Khoo et al., 2018).
Plumbago scandens es ampliamente usada en la medicina
tradicional en países de Asia, África y América. En América
es frecuente encontrarla desde Estados Unidos hasta Bolivia
(Farcio-villarreal et al., 2015; Karishma et al., 2018; Logarto
Parra et al., 2001; Mengane Kemble, 2015; Muralidharan et
al., 2018; Murov, 2010; Nair et al., 2016; Riveiro de Paiva et
al., 2003; Singh et al., 2017) y sus propiedades terapéuticas
son referidas en varias publicaciones (Abdallah, 2016;
Apenteng et al., 2016; Hassan et al., 2016; Karishma et al.,
2018; Kaur et al., 2016; Roy Bharadvaja, 2017a, 2017b;
Singh et al., 2017). En Ecuador P. scandens se considera
una planta nativa, tanto en la región costa como sierra,
hasta los 1500 metros en las provincias de Bolívar, El Oro,
Esmeraldas, Guayas, Zamora (hierba de la culebra), Loja
y Manabí donde es conocida como Churupa (Jorguensen
Leon Yánez, 1999; Valverde Badillo, 1998).
Se considera que la actividad antimicrobiana, antimicótica
y anticancerígena de P. scandens se debe a la presencia
de la plumbagina, una naftoquinona presente en toda la
planta, especialmente en las raíces (Ahamed Khan et al.,
2014; Chaudhari Chaudhari, 2015; Chauhan et al., 2012;
Farcio-villarreal et al., 2015; Malar Tharmaraj Marimuthu
Antonysamy, 2016; Muralidharan et al., 2018; Roy Bharad-
vaja, 2017b; Sobhani et al., 2018). El análisis fitoquímico
de esta planta revela la presencia de alcaloides, glucósidos,
azúcares reductores, fenoles simples, taninos, lignina, sapo-
nina, terpenoides, esteroides y flavonoides, mas no revela
la presencia de aceites esenciales (AE) (Banik et al., 2014;
Dhale Markandeya, 2011; Najafpour Navaei et al., 2005;
Subhash et al., 2013).
Estudios sobre las propiedades antimicrobianas de ex-
tractos de P. scandens, desarrollados en el Laboratorio de
Fitoquímica de la Universidad Nacional de Loja, revelaron
que el extracto hexánico es activo contra varias especies
de bacterias (Morocho-Yaguana et al., 2019), pero esta
actividad decrece con el tiempo, presumiéndose que se debe
a metabolitos secundarios como los AE o a la degradación
de esos metabolitos. Este antecedente, sumado a la presencia
de AE en otras especies del género Plumbago (Najafpour
Navaei et al., 2005), sirvió de base para considerar los AE
de esta especie.
El presente estudio planteó evaluar la actividad antimicó-
tica, por el método de Kirby Bauer, del AE de P. scandens
purificado por cromatografía de columna, utilizando como
referentes especies de hongos ATCC.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención del aceite esencial de P. scandens
P. scandens se colectó en la ciudad de Palanda, Provincia
de Zamora Chinchipe (sur de Ecuador), en octubre de 2017,
y una muestra fue identificada por el Ing. Bolívar Merino,
taxónomo del Herbario Reinaldo Espinosa de la Universidad
Nacional de Loja y codificado con el váucher EC14-069.
Una muestra de 8,7 kg de planta fresca fue lavada con
solución de hipoclorito de sodio al 0,5%, enjuagada con
agua corriente, escurrida, secada a la sombra y refrigerada
en un recipiente de polietileno. La planta entera fue troceada
y sometida a destilación por arrastre de vapor, recogiéndose
los destilados de color amarillento en un balón en baño de
hielo. Los destilados fueron lavados con n-hexano por tres
ocasiones y estos fueron concentrados en un evaporador
rotatorio Yamato RE-200 a 30 ºC.
El producto, cristales de color amarillo, fue almacenado
en un balón de vidrio, protegido de la luz y en refrigeración.
Una muestra de los cristales fue rediluida en n-hexano y se
desarrolló una cromatografía en capa fina (TLC) con silica-
gel 60 F254 (Merck®) usando como eluyente una mezcla
hexano:acetato de etilo 80:20 y en la cual se evidenció la
presencia de varias franjas visibles con luz ultravioleta de
254 nm.
El aislamiento de la fracción bioactiva se realizó por cro-
matografía de columna, guiada por autobiografía (Choma,
2005; Lockhart, 1954), usando silicagel 60 (0,063-0,200
mm, Merck®) y como eluyente una mezcla de hexano:dietil
éter 5:0,4. Se obtuvieron 22 fracciones, a las cuales se les
desarrolló una TLC usando el mismo eluyente, las fraccio-
nes bioactivas 5-9, de color amarillo y con idéntico perfil por
TLC, fueron unidas y concentradas en evaporador rotatorio
a 30 ºC y recristalizadas con acetona. Se obtuvo 830 mg de
cristales, en forma de aguja, de color amarillo ocre y olor
7
e-ISSN: 1390-5902
CEDAMAZ Revista del Centro de Estudio y Desarrollo de la Amazonia , Vol. 11, No. 1, pp. 6–12, enero–junio 2021
bastante penetrante, los cuales fueron conservados en refri-
geración
Elaboración de discos de sensibilidad
Con el AE purificado se prepararon soluciones de 50, 25
y 12,5 µg/mL en acetona. Con 10 µL de las soluciones se
impregnaron discos de papel Whatman Nº 3 de 6 mm de
diámetro obteniéndose discos con una concentración final
de 0,5, 0,25 y 0,125 µg/disco. Los discos preparados fueron
esterilizados con luz ultravioleta de 254 nm y 55W por 30
minutos.
Como control positivo se usaron discos de nistatina de 100
UI (Unidades Internacionales) y para el control negativo se
esterilizaron en autoclave discos de papel Whatman Nº 3, de
6 mm de diámetro y se impregnaron con 10 µL de acetona
esterilizada por filtración con filtros de jeringuilla de 0,22
µm (Millex GV ®).
Cepas de hongos utilizadas
Se usaron cepas de Candida albicans (ATCC 26790), Cry-
ptococcus neoformans (ATCC 14116), Aspergillus brasilien-
sis (ATCC 16404) y Trichophytum rubrum (ATCC 28188)
viabilizadas según las recomendaciones del fabricante y con-
servadas por pases sucesivos en medio Agar Dextrosa Sabou-
rad e incubadas a 28 ºC (incubadora MRC, BOD-80 ®).
Preparación del inóculo
El inóculo se preparó por suspensión de las cepas jóve-
nes en solución salina, equivalente al tubo 0,5 de la escala de
MacFarland (aproximadamente 108 UFC/mL). Con las ce-
pas filamentosas, el inóculo se preparó tocando las conidias
de la superficie del cultivo de 7 días de edad con un asa mi-
crobiológica y se suspendieron en 4 mL de solución salina
estéril. El contenido se agitó por 30 segundos en un vórtex
y se dejó sedimentar durante 4 minutos. El sobrenadante se
transfirió a otro tubo y se diluyó, ajustando la densidad de la
suspensión de conidias a 0,5 de la escala MacFarland.
Medios de cultivo
Los ensayos se desarrollaron en medio de cultivo Muller
Hinton, enriquecido con 20 g de glucosa y 100 µl de la so-
lución de azul de metileno (5 mg/mL) por litro de medio y
distribuido en cajas Petri de 90 mm de diámetro a razón de
20 mL/caja.
Evaluación de actividad antimicótica
La evaluación de la actividad antimicótica se desarro-
lló según la metodología de Kirby Bauer, con discos de
sensibilidad en papel filtro (Bauer et al., 1966; Biemer,
1973; Boyle et al., 1973; Hudzicki, 2009; Stratton, 1984)
y las recomendaciones del Clinical Laboratory Standards
Institute (CLSI) (Lacasa Mazuelos, 2007). Para ello se
sumergió un hisopo en la suspensión de conidias, se eliminó
el exceso por rotación y el contenido se inoculó por estría en
cajas de agar Muller Hinton enriquecido.
Pasados 15 minutos, en cada caja se colocó un disco de
prueba (P), un control negativo (CN) y un control positivo
(CP), se dejaron reposar por 15 minutos, se invirtieron y se
incubaron a 35 ºC ± 2 por 48 horas (MRC, BOD-80 ®); de
cada dilución se realizaron ensayos por triplicado. Se consi-
deró como halo de inhibición las zonas alrededor del disco
de sensibilidad que no presentaban crecimiento visible; los
halos se midieron en mm a las 48 horas de incubación.
RESULTADOS
La evaluación de la actividad antimicótica se desarro-
lló según la metodología de Kirby Bauer, con discos de
sensibilidad en papel filtro (Bauer et al., 1966; Biemer,
1973; Boyle et al., 1973; Hudzicki, 2009; Stratton, 1984)
y las recomendaciones del Clinical Laboratory Standards
Institute (CLSI) (Lacasa Mazuelos, 2007). Para ello se
sumergió un hisopo en la suspensión de conidias, se eliminó
el exceso por rotación y el contenido se inoculó por estría en
cajas de agar Muller Hinton enriquecido.
Pasados 15 minutos, en cada caja se colocó un disco de
prueba (P), un control negativo (CN) y un control positivo
(CP), se dejaron reposar por 15 minutos, se invirtieron y se
incubaron a 35 ºC ± 2 por 48 horas (MRC, BOD-80 ®); de
cada dilución se realizaron ensayos por triplicado. Se consi-
deró como halo de inhibición las zonas alrededor del disco
de sensibilidad que no presentaban crecimiento visible; los
halos se midieron en mm a las 48 horas de incubación.
Fig. 1: Halos de inhibición con discos de 0,125 µg/disco en
Trichophytum rubrum (A), Cryptococcus neoformans (B), Candida
albicans (C) y Aspergillus brasiliensis (D). CP= control positivo;
CN= control negativo; P= prueba.
En la tabla 1 se exponen los promedios de los halos de
inhibición, evidenciándose que, a 0,125 µg/disco, T. rubrum
presentó la mayor sensibilidad al tiempo que C. albicans no
la presentó. Se resalta el hecho de que, a la mayor concen-
tración 0,5 µg/disco, T. rubrum, igualmente, presenta mayor
sensibilidad, y C. albicans la menor.
DISCUSIÓN
El ensayo de sensibilidad de Kirby-Bauer, aplicado en
la presente investigación, es una prueba muy usada en la
evaluación de la actividad antimicrobiana y cuyos proce-
dimientos fueron validados por una prueba piloto usando
especies ATCC referenciadas de los microorganismos
(Hudzicki, 2009).
La literatura especializada reporta varios estudios en los
que se pone de manifiesto el amplio y arraigado uso de
P. scandens con una amplia gama de propiedades, como
abortivas, antituberculosas, laxantes y expectorantes, así
como para tratar cólicos estomacales, flatulencias, dolor de
muelas, gangrena, escabiosis y leishmaniasis (Abera et al.,
8
ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA DEL ACEITE ESENCIAL DE PLUMBAGO SCANDEN MOROCHO-YAGUANA et al.
Tabla 1: Promedios y desviación estándar (paréntesis) de los diámetros de halos de inhibición de las concentraciones del AE de P.
scandens (mm.). CP= control positivo; CN= control negativo; P= prueba; -, sin halo de inhibición.
Microorganismo
0,50 µg/disco 0,25 µg/disco 0,125 µg/disco
CP CN P CP CN P CP CN P
C. albicans 29 (1,73) - 13 (1,00) 28 (0,58) - 12 (1,15) 30 (1,15) - -
A. brasiliensis 27 (0,58) - 29 (0,58) 27 (1,54) - 20 (0,58) 27 (1,15) - 10 (1,00)
T. rubrum 21 (0,58) - 36 (0,58) 19 (1,73) - 32 (-) 20 (0,58) - 28 (0,58)
C. neoformans 27 (1,53) - 34 (1,53) 27 (3,60) - 28 (3,60) 22 (3,46) - 21 (-)
2008; Adegbite et al., 2014; Apenteng et al., 2016; Chaudha-
ri Chaudhari, 2015; Ganesan Gani, 2013; Karishma et al.,
2018; Pant et al., 2012; Ribeiro et al., 2014; Riveiro de Paiva
et al., 2003; Roy Bharadvaja, 2017b, 2017a; A. Sharma
Singh, 2015; N. Sharma Kaushik, 2014; Valverde Badillo,
1998).
Muchos de los trabajos publicados mencionan, es-
pecialmente, las propiedades antibacterianas (Karthika,
2015; Malar Tharmaraj Marimuthu Antonysamy, 2016;
Morocho-Yaguana et al., 2019; Nair et al., 2016; Shweta
Dubey, 2015; Singh et al., 2017) y antifúngicas de extractos
con variadas metodologías y, mayoritariamente, se refie-
ren a C. albicans (Hassan et al., 2016; Mehmood et al.,
1999; Mengane Kemble, 2015; Rathanavel et al., 2014;
Sepahvand. A , Ezatpour. B., F.Tarkhan , Mahmoud Bah-
mani Razi, 2017; Soo Khoo et al., 2018; Uniyal et al., 2014).
Existen estudios sobre la actividad antimicótica de extrac-
tos de las partes aéreas de P. scandens, aplicando varias me-
todologías contra Trichosporon asahhi, Trichosporon inkin,
C. albicans, Epidermophyton floccosum, Microsporum gy-
pseum y Trichophyton rubrum (de Paiva et al., 2003; Hassan
et al., 2016; Mehmood et al., 1999; S. Sharma et al., 2012;
Shweta Dubey, 2015). El presente estudio demuestra que
es factible obtener el AE de P. scandens por arrastre de va-
por y el aislamiento, por cromatografía de columna y bio-
guiada por bioautografía, de una fracción bioactiva; también
aporta nueva información a la ya existente sobre las activi-
dad antimicrobianas de extractos de P. scandens (Banik et
al., 2014; Hassan et al., 2016; Nair et al., 2016; Shweta Du-
bey, 2015) con la actividad antimicótica de la fracción aisla-
da del AE contra C. albicans, T. rubrum, A. brasiliensis y C.
neoformans a concentraciones tan pequeñas como las ensa-
yadas, quedando pendiente la identificación molecular del o
los componentes de la fracción activa.
CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES
Conceptualización: LMY y ACLl; metodología: LMY
y ACl;análisis formal: LMY, HRJ y GCM.; investigación:
LMY y ACLl; recursos: UNL y ACLl; curación de datos:
LMY, ACLl y HRJ; redacción — preparación del borrador:
LMY, ACLl y GRM; redacción — revisión y edición: LMY,
GCM y HRJ; visualización: LMY; supervisión: LMY; admi-
nistración de proyecto: LMY; adquisición de financiamiento
para la investigación: LMY y ACLl. Todos los autores han
leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.
FINANCIAMIENTO
Este proyecto fue financiado por la Universidad Nacional
de Loja.
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