e-ISSN: 1390-5902
CEDAMAZ Revista del Centro de Estudio y Desarrollo de la Amazonia , Vol. 11, No. 01, pp. 43–47, enero–junio 2021
Primer informe de Leishmania naiffi en Zamora Chinchipe (Ecuador)
utilizando el gen que codifica la proteína HSP70
First report of Leishmania naiffi in Zamora Chinchipe (Ecuador) using the gene
encoding the HSP70 protein
Luis Alberto Morocho-Yaguana
1,*
, Gina Stefany Jaramillo-Balcázar
1
, Franklin Román-Cárdenas
2
y
Loidy Zamora-Gutiérrez
2
1
Carrera de Laboratorio Clínico, Facultad de la Salud Humana, Universidad Nacional de Loja. Loja, Ecuador
2
Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja. Loja, Ecuador
*
Autor para correspondencia: luis.morochoy@unl.edu.ec
Fecha de recepción del manuscrito: 31/07/2020 Fecha de aceptación del manuscrito: 08/06/2021 Fecha de publicación: 15/07/2021
Resumen—En Ecuador se encuentran informadas algunas de las especies de Leishmania pertenecientes al subgénero Viannia (V), causante
de enfermedades como leishmaniasis cutánea, cutánea difusa no curativa y mucocutánea. El objetivo de este trabajo fue diagnosticar
molecularmente posibles casos de leishmaniasis cutánea, a partir de muestras obtenidas por raspado para microscopía y aspirado de linfa
para cultivo, en los cantones Palanda y Chinchipe de la provincia Zamora Chinchipe. Se realizó la extracción de ADN de las muestras y la
amplificación del gen que codifica la proteína HSP70 mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se obtuvieron amplicones
de 1422 pb, los cuales fueron purificados y enviados a Macrogen Inc., Korea del Sur, para su secuenciación. Las secuencias presentaron un
91% de identidad con Leishmania naiffi, lo que constituye el primer reporte de esta especie para la provincia Zamora Chinchipe.
Palabras clave—Leishmania naiffi, HSP70, Leishmaniasis, Zamora Chinchipe, Ecuador.
Abstract—In Ecuador some of the Leishmania species belonging to the subgenus Viannia (V.) are found, causing diseases such as
cutaneous, diffuse non-curative cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. The aim of this work was to molecularly diagnose possible
cases of cutaneous leishmaniasis, from samples obtained by scraping for microscopy and lymph aspiration for culture, in Palanda and
Chinchipe cantons of the Zamora Chinchipe province. Extraction of DNA from the samples and amplification of the gene encoding the
HSP70 protein were performed using the Polymerase Chain Reaction (PCR). 1422 bp amplicons were obtained, which were purified and
sent to Macrogen Inc., South Korea, for sequencing. The sequences presented 91% identity with Leishmania naiffi, which constitutes the
first report of this species for the Zamora Chinchipe province.
Keywords—Leishmania naiffi, HSP70, Leishmaniasis, Zamora Chinchipe, Ecuador.
INTRODUCCIÓN
L
eishmaniasis es una enfermedad de piel, mucosas
o vísceras causadas por protozoarios unicelulares
del género Leishmania, transmitido al hombre mediante
la picadura de dípteros de los géneros Phlebotomus y
Lutzomyia. El género Leishmania es digenético y se divide
en dos subgéneros, según su desarrollo en el intestino de
los flebótomos: Leishmania en el intestino medio o anterior
y Viannia en el intestino posterior, y está establecido por
diferentes complejos y especies (Cárdenas Alegría et al.,
2012).
Alrededor de 20 especies de Leishmania son patógenas
para los seres humanos (Kato et al., 2013). Según las ma-
nifestaciones clínicas que se presenten se pueden clasificar
de diferente manera: leishmaniasis cutánea leishmaniasis
mucocutánea, leishmaniasis cutánea difusa no curativa
y leishmaniasis visceral (Montalvo A. et al., 2012). La
sintomatología no solo depende del estado inmunológico
del paciente, sino también de la especie parásita. Otros
autores refieren que existe una predisposición genética del
hospedero (Montalvo et al., 2016).
Esta enfermedad es principalmente endémica en regiones
tropicales y subtropicales, con 350 millones de personas
en riesgo de padecerla (Alvar et al., 2012). Se considera
que cada año hay de 1,5 a 2 millones de nuevos casos, de
los cuales 500.000 corresponden a la forma visceral; el
resto a casos de leishmaniasis cutánea y, en un porcentaje
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menor, a leishmaniasis mucocutánea (Montalvo et al.,
2016). En los países andinos, la enfermedad es preva-
lente desde Venezuela al norte de Argentina, a través de
Colombia, Ecuador, Perú y Bolivia (Hashiguchi et al., 2018).
En Ecuador se han reportado siete especies del género
Leishmania : L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) panamensis,
L. (V.) guyanensis, L. (V.) naiffi, L. (Leishmania) mexicana,
L. (L.) amazonensis y L. (L.) major-like (Olalla et al., 2015;
Kato et al., 2016; Calvopina et al., 2004). Sin embargo,
existe información limitada sobre las especies presentes en la
zona de estudio. Dada la relación existente entre la especie y
las manifestaciones clínicas de la enfermedad, su evolución,
susceptibilidad al tratamiento y manejo epidemiológico, es
necesario realizar la correcta identificación de la especie que
se esté tratando (Akhoundi et al., 2017).
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), el
diagnóstico de la leishmaniasis se realiza mediante la com-
binación de un examen clínico con pruebas parasitológicas
o serológicas. En áreas endémicas el examen microscópico
sigue siendo un diagnóstico útil en los niveles de atención
primaria de salud debido a su rentabilidad y simplicidad
(Akhoundi et al., 2017). Sin embargo, las pruebas serológi-
cas tienen un valor limitado en las leishmaniasis cutánea y
mucocutánea (OMS, 2020).
La técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa es
ampliamente utilizada en la identificación de especies de
Leishmania. El gen que codifica para la proteína HSP70 ha
resultado útil para el diagnóstico e identificación de especies,
ya que es altamente conservado en numerosos organismos
y no está sujeto a selección. Esta diana permite discriminar
entre varias especies del subgénero L. Viannia y estudiar
las relaciones filogenéticas de estas especies (Kato et al.,
2016). Se han realizado estudios basados en extracción de
ADN de leishmanias a partir de cultivos in vitro en medio
Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) y de placas fijadas teñidas
con Giemsa provenientes de lesiones presentes en pacientes
(Schönian et al., 2010).
El objetivo de este trabajo fue diagnosticar molecularmen-
te posibles casos de leishmaniasis cutánea, a partir de mues-
tras obtenidas por raspado para microscopía y aspirado de
linfa para cultivo, en los cantones Palanda y Chinchipe de la
provincia Zamora Chinchipe (región sur del Ecuador).
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestreo
Para el muestreo se recopiló información del MSP y se
aplicaron encuestas para ubicar posibles casos de leish-
maniasis en zonas endémicas de los cantones Palanda y
Chinchipe, en la provincia de Zamora Chinchipe. Como
criterios de inclusión se consideraron a pacientes que pre-
sentaron úlceras que no cicatrizaban y eran compatibles con
leishmaniasis, casos antiguos sin remisión de la enfermedad
o casos que se encontraban en tratamiento y firmaron el
consentimiento informado.
Durante la búsqueda se encontraron dos casos que cum-
plieron los criterios de inclusión, de los cuales se tomaron
muestras de acuerdo a protocolos validados para microscopía
y aspirado de linfa para cultivo, todo previa firma del consen-
timiento informado (Figura 1) (OMS y OPS, 2019).
Fig. 1: Obtención de linfa por aspirado de los bordes periféricos en
paciente masculino con lesión en la mejilla derecha, del cantón
Chinchipe, Ecuador.
Aislamientos clínicos y microscopía
Las muestras obtenidas del aspirado de linfa fueron culti-
vadas en medio NNN e incubadas a 27 °C, mientras que los
raspados de las lesiones fueron colocados sobre portaobje-
tos, secados a temperatura ambiente, y teñidos con Giemsa
para la microscopía (Microscopio Olympus 100X) según lo
descrito en el Manual de procedimientos para la vigilancia y
control de las leishmaniasis en las Américas (OPS, 2019).
Extracción y amplificación de ácidos nucleicos
La extracción de ADN a partir de muestras de raspado
cutáneo y de cultivo se realizó utilizando el kit Pure LinkTM
Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen®) de acuerdo con lo
descrito por Motazedian et al. (2003). La amplificación
de ácidos nucleicos se realizó a partir de la región de
1422 pb perteneciente al gen que codifica para la proteína
de choque térmico del citoplasma HSP70, para lo que
se emplearon los cebadores descritos por Garcia et al.
(2004), hsp70sen 5’GACGGTGCCTGCCTACTTCAA3’ y
hsp70ant 5’CCGCCCATGCTCTGGTACATC3’y descritos
para la identificación específica de diferentes especies de
Leishmania.
El volumen final de la reacción de amplificación fue de
50µ l, con tampón de concentración 1 x (Invitrogen, USA),
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MgCl2 1,5 mM, desoxinucleósido trifosfato de concentra-
ción 200 µM cada uno, dimetilsulfóxido al 5%, 20 pmol
de cebadores y 2,5 U de ADN polimerasa Taq (Invitrogen,
USA) (Garcia et al., 2004).
El programa de amplificación utilizado fue de una tempe-
ratura de 94 °C durante 5 min, seguido de 33 ciclos, cada
uno de los cuales constaba de 30 segundos a 94 °C, 1 min a
61 °C, 3 min a 72 °C y un paso de extensión final de 10 min
a 72 °C (Garcia et al., 2004).
Los productos amplificados del gen que codifica la
proteína HPS70 de ambas muestras se observaron mediante
electroforesis en geles de agarosa al 1% en tampón TBE al
1x (Figura 2). Los geles fueron visualizados con fotodocu-
mentador EnduroTM GDS Touch, marca Labnet, utilizando
el colorante Sybr Safe (Invitrogen).
Como controles positivos se utilizó ADN extraído de cul-
tivos de promastigotes de L. braziliensis, L. guyanensis y
L. major-like, gentilmente donados por el Instituto Oswaldo
Cruz, Brasil.
Análisis de secuencias
Los amplicones fueron enviados a secuenciar en el labo-
ratorio Macrogen Inc. Korea del Sur. Las secuencias par-
ciales obtenidas se analizaron con la herramienta BLASTn
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov); posteriormente, fueron pro-
cesadas con el programa ChromasPro (versión 2.1.10) para
obtener secuencias consenso, las cuales se alinearon median-
te el análisis Clustal Wallis con diferentes aislados de refe-
rencia. Las secuencias fueron comparadas con las que se en-
cuentran en la base de datos National Center for Biotechno-
logy Information (NCBI) (Zheng et al., 2000).
RESULTADOS
Dos pacientes menores de un año, de los cantones
Chinchipe y Palanda, presentaron lesiones compatibles con
leishmaniasis; las lesiones se ubicaron en la mejilla derecha
de cada paciente. La madre del paciente 2 refirió que el niño
había recibido cuatro dosis del medicamento Glucantime®.
Aislamientos clínicos y microscopía
El análisis microscópico mostró la presencia de amas-
tigotes en ambas muestras. El cultivo de la muestra 1 fue
positivo, observándose la presencia de promastigotes carac-
terísticos del género Leishmania, mientras que el aislamiento
in vitro para la muestra número 2 resultó negativo.
Amplificación de ácidos nucleicos
De los productos amplificados del gen que codifica la pro-
teína HPS70 para ambas muestras, se obtuvieron bandas de
aproximadamente 1422 pb (Figura 2), correspondientes al
género Leishmania, y fueron coincidentes con los controles
positivos empleados en la reacción en cadena de la polime-
rasa.
Fig. 2: Análisis electroforético de productos de PCR de muestra Nº
1 en geles de agarosa amplificando la proteína HSP70. Línea 1:
Marcador de tamaño de ADN-ladder 100-3000 pb; Línea 2:
Control negativo, agua ultrapura; Línea 3: Control positivo, ADN
de L. guyanensis; Línea 8: Muestra aislada de paciente.
Análisis de secuencias
Una vez obtenidas las secuencias, utilizando el programa
BLAST, se determinó que las muestras 1 y 2 presentan un
91% de identidad con las secuencias de L. naiffi publicadas
en la base de datos del NCBI.
DISCUSIÓN
El método por microscopía resultó ser sensible, ya que
ambas muestras mostraron la presencia de amastigotes.
A pesar de ser muy económico no proporciona la discri-
minación entre especie y su sensibilidad depende en gran
medida del número y dispersión de parásitos de la muestra.
Muchos autores creen necesario la experticia del personal
para un diagnóstico. En áreas endémicas sigue siendo un
método útil a nivel primario de atención de salud debido a
su rentabilidad (Akhoundi et al., 2017).
En cuanto al cultivo, este tiene mucha importancia para
el diagnóstico de rutina. Lamentablemente, la recuperación
de parásitos en cultivo rara vez supera el 70%, incluso
para cepas que se mantienen fácilmente in vitro. El cultivo
requiere medios especializados y costosos; además, resulta
lento y requiere de un laboratorio equipado y de elevada
complejidad (Berman, 1997).
La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica
altamente sensible y específica, a diferencia de métodos
microscópicos y de cultivo (Montalvo A. et al., 2012). En
estudios similares se ha utilizado como diana principal el gen
HSP70 seguido de la secuenciación de los productos de PCR
(Garcia et al., 2004; Montalvo et al., 2016; Montalvo Ana
et al., 2014) para la caracterización de la especie a partir de
raspados cutáneos (Torres et al., 2018) para un diagnóstico
eficaz que aporte a la epidemiología y tratamiento oportuno.
Según informes de la OMS, la epidemiología de la
leishmaniasis cutánea en las Américas es muy compleja,
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pues se observan variaciones en los ciclos de transmisión,
los reservorios, los flebótomos vectores, las manifestaciones
clínicas y la respuesta al tratamiento. Además, hay varias
especies de Leishmania en la misma zona geográfica (OMS,
2020). El primer reporte de esta enfermedad fue realizado
por Valenzuela en Ecuador en 1920, en Esmeraldas (Hashi-
guchi et al., 2018).
Posteriormente Calvopina et al. (2004) y colaboradores
informan de la presencia de las especies L. panamensis, L.
guyanensis, L. braziliensis, L. mexicana, L.amazonensis, L.
major like y de los híbridos L. panamensis/guyanensis y L.
guyanensis/braziliensis. Los primeros reportes de Leishma-
nia naiffi en Ecuador según Kato et al. (2013) fueron en el
norte de la selva amazónica, en militares de edad adulta, y
fue identificada usando como diana el gen que codifica para
la proteína citocromo b (Kato et al., 2013). En la amazonía
se identificaron L. guyanensis, L. braziliensis, L. lainsoni y
L. naiffi, y en la provincia de Zamora Chinchipe únicamente
se ha reportado la presencia de L. braziliensis (Kato et al.,
2016), por lo que este estudio constituye el primer informe
de la presencia de L. naiffi para esta provincia.
La metodología usada permitió la identificación de L. naif-
fi a pesar de que una de las muestras provino de un paciente
al cual ya se le había administrado 4 dosis de Glucantime®.
Así y todo, la técnica permitió el diagnóstico e identificación
de especies de leishmania, lo que concuerda con lo descrito
por Muñoz en 2015.
CONCLUSIONES
Se confirmó a través de diagnóstico molecular la presen-
cia de L. naiffi en la provincia de Zamora Chinchipe usando
como diana la secuencia parcial del gen que codifica para la
proteína de choque térmico HPS70. Se cuenta con una meto-
dología de diagnóstico que facilita el pronóstico de lesiones
cutáneas que puedan evolucionar a lesiones mucocutáneas
siendo muy importante para casos de pacientes inmunocom-
prometidos.
CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES
Conceptualización: LMY, GJB, LZG; metodología: LMY,
FRC y GJB; análisis formal: LMY, GJB y LZG.; investiga-
ción: LMY, GJB, LZG y FRC; recursos: GJB y UNL; cura-
ción de datos: LMY, FRC y LZG; redacción — preparación
del borrador: LZG y LMY; redacción — revisión y edición:
LZG y LMY; visualización: LMY y LZG; supervisión: LMY;
administración de proyecto: LMY; adquisición de financia-
miento para la investigación: LMY y GJB. Todos los autores
han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.
FINANCIAMIENTO
Esta investigación ha sido financiada por la Universidad
Nacional de Loja a través del proyecto 20-DI-FSH-2019.
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