e-ISSN: 1390-5902
CEDAMAZ, Vol. 14, No. 2, pp. 110–116, Julio – Diciembre 2024
DOI: 10.54753/cedamaz.v14i2.1837
Establecimiento de protocolos de cultivo y mantenimiento de Acanthamoeba
castellanii
Establishment of culture and maintenance protocols for Acanthamoeba castellanii
Daniela Román-Cáceres1,*, Ana Claudia Samaniego-Villacís1, Adamary Vásquez1y Jorge
Armijos-Rivera 1
1Grupo de Investigación de Genética y Biología Molecular, Universidad Nacional de Loja, Loja, Ecuador
*Autor para correspondencia: daniela.roman@unl.edu.ec
Fecha de recepción del manuscrito: 04/04/2023 Fecha de aceptación del manuscrito: 20/12/2024 Fecha de publicación: 31/12/2024
Resumen—El género Acanthamoeba abarca diversas especies de amebas de vida libre, se aíslan con frecuencia de distintas fuentes am-
bientales como el agua, el suelo y el aire. Varias especies son conocidas por causar infecciones y enfermedades en humanos y animales.
Además, amebas como Acanthamoeba castellanii se reconoce como un relevante reservorio de virus, brindándoles protección contra con-
diciones ambientales adversas, en particular de virus del tipo nucleocitoplasmáticos de gran tamaño, también llamados virus gigantes, los
cuales pueden ser aislados mediante la inoculación directa de cultivos de Acanthamoeba castellanii con muestras de agua de cuerpos lacus-
tres. Este estudio se centró en establecer protocolos de cultivo en laboratorio para Acanthamoeba castellanii ATCC 30010, con el objetivo
de comprender mejor la respuesta de estas amebas al entorno y sus interacciones con depredadores de protozoos. Desarrollamos y aplica-
mos un enfoque para evaluar la viabilidad de este género en un medio líquido de proteasa-peptona-glucosa y un medio sólido no nutritivo,
utilizando Escherichia coli ATCC 25922 como sustrato. La incubación a temperaturas específicas y un mantenimiento regular permitieron
establecer cultivos axénicos de Acanthamoeba castellanii ATCC 30010. Mediante la observación bajo un microscopio invertido (10x y
40x), se verificó el crecimiento de Acanthamoeba, confirmando el estado de trofozoitos de las células y la presencia de la vacuola amebal
en ambos tipos de cultivo.
Palabras clave—Acanthamoeba castellanii,Escherichia coli, cultivos axénicos, medio PYG.
Abstract—The genus Acanthamoeba encompasses various species of free-living amoebas, often isolated from different environmental
sources such as water, soil, and air. Several species are known to cause infections and diseases in both humans and animals. Additionally,
amoebas like Acanthamoeba castellanii are recognized as significant reservoirs of viruses, providing protection against adverse environ-
mental conditions, especially nucleocytoplasmic large DNA viruses, also known as giant viruses. These viruses can be isolated by directly
inoculating Acanthamoeba castellanii cultures with water samples from lacustrine bodies. This study focused on establishing laboratory
cultivation protocols for Acanthamoeba castellanii ATCC 30010, aiming to better understand the response of these amoebas to the envi-
ronment and their interactions with protozoan predators. We developed and implemented an approach to assess the viability of this genus
in a liquid medium of protease-peptone-glucose and a non-nutritive solid medium, using Escherichia coli ATCC 25922 as a substrate.
Incubation at specific temperatures and regular maintenance allowed for the establishment of axenic cultures of Acanthamoeba castellanii
ATCC 30010. Through observation under an inverted microscope (10x and 40x), the growth of Acanthamoeba was verified, confirming the
trophozoite state of the cells and the presence of the amoebal vacuole in both types of culture.
Keywords—Acanthamoeba castellanii,Escherichia coli, axenic cultures, PYG medium.
INTRODUCCIÓN
El género Acanthamoeba se descubrió en 1931 (Weis-
man, 1976), describiéndose como amebas caracteriza-
das por su morfología de trofozoítos y quistes, lo que lle-
vó a grandes confusiones durante mucho tiempo en la lite-
ratura sobre su nomenclatura y estado taxonómico (Weis-
man, 1976). Posteriormente, en 1975 se posicionó al género
Acanthamoeba en el esquema taxonómico de la Sociedad de
Protozólogos (Visvesvara, 1991) y desde entonces se cono-
ce que estas amebas de vida libre están adaptadas para vivir
en una variedad de entornos naturales y entornos creados por
actividades humanas (Caumo et al., 2014). Estas Acantha-
moeba se aíslan con frecuencia de distintas fuentes ambien-
tales, como el agua, el suelo, el polvo y el aire, y son capaces
de resistir condiciones extremas como tiempo prolongado de
desecación, temperatura alta/baja, ambientes alcalinos o áci-
dos y exposición elevada a radiación (Landell et al., 2013).
Es así como este género ha ido ganando atención de la comu-
Esta obra está bajo una licencia internacional Creative Commons Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0. 110
ESTABLECIMIENTO DE PROTOCOLOS DE CULTIVO ROMÁN-CÁCERES et al.
nidad científica a lo largo de los años, debido a sus roles ver-
sátiles en el ecosistema. Adicionalmente, se han identificado
unas 24 especies dentro del género, de las cuales, varias se
consideran como importantes patógenos humanos: Acantha-
moeba castellanii, A. polyphaga, A. astronyxis, A. hatchetti,
A. culbertsoni, A. healyi yA. byersi (Landell et al., 2013).
Por otra parte, Acanthamoeba spp. son considerados un
importante reservorio de bacterias, virus y hongos, ya que es-
tos microorganismos se protegen de las condiciones ambien-
tales desfavorables dentro del sistema celular de Acantha-
moeba spp. (Siddiqui y Khan, 2012).
Posteriormente, los microorganismos regresan al me-
dio ambiente con implicaciones de interacciones parásito-
parásito, que pueden contribuir a la evolución y transmisión
exitosa de microorganismos en el medio ambiente. Sin em-
bargo, la naturaleza exacta de la simbiosis y el beneficio que
representan para las amebas anfitrionas aún no están claros
(Greub y Raoult, 2004).
Según Siddiqui y Khan (2012), el género Acanthamoeba
desempeña dos funciones ecológicas principales en el suelo:
el reciclaje de nutrientes y la formación de la estructura de
la comunidad microbiana. En general, Acanthamoeba pue-
de desarrollar una función importante en la regulación de las
poblaciones, contribuyendo al comportamiento de los ecosis-
temas (Greub y Raoult, 2004).
El ciclo de vida de Acanthamoeba spp. se divide en dos
etapas: el trofozoito y el quiste. Los tamaños de los trofozoi-
tos y quiste varían entre las diferentes especies de Acantha-
moeba (Siddiqui y Khan, 2012). Tanto el trofozoito como el
quiste se caracterizan por un solo núcleo que tiene un gran
nucléolo denso y central. Cuando el trofozoito se divide rá-
pidamente por mitosis, la membrana nuclear y el nucléolo
desaparecen. El trofozoito, cuando se encuentra en condicio-
nes desfavorables, se enquista y dichos quistes pueden tener
una morfología variada pudiendo ser poliédricos o convexos
con paredes dobles; cuando el quiste es externo se conoce
como ectoquiste y endoquiste cuando es interno (´
Swiderski,
2009)
El género Acanthamoeba se alimenta de microorganismos
presentes en superficies, en diversos ambientes (Khan, 2006)
e incluso en la interfase aire-agua conocida como zona pe-
lágica (Siddiqui y Khan, 2012). Las estructuras espinosas
o acanthopodia que surgen de la superficie de los trofozoí-
tos de Acanthamoeba pueden usarse para capturar partícu-
las de alimentos, que generalmente son bacterias (´
Swiderski,
2009), pero también se alimentan de algas, levaduras (Khan,
2006) y otros protistas. La absorción de nutrientes, solutos
etc. en Acanthamoeba se produce por fagocitosis y pinoci-
tosis. Estas amebas pueden tomar solutos de diferentes pe-
sos moleculares, incluyendo albúmina (Mw 65 000), inulina
(Mw 5000), glucosa (Mw 180) y leucina (Mw 131) ((de Sou-
za Gonçalves et al., 2018). Posteriormente a la absorción de
partículas, Acanthamoeba exhibe la capacidad de distinguir
vacuolas que contienen partículas digeribles e indigeribles.
Por ejemplo, Bowers y Olszewski (1983) demostraron que
el destino de las vacuolas dentro de Acanthamoeba depende
de la naturaleza de las partículas. Adicionalmente, estudios
sobre la absorción de partículas en Acanthamoeba sugieren
que es un proceso complejo que puede desempeñar un papel
importante tanto en la supervivencia como en la patogenia de
estos organismos (de Souza Gonçalves et al., 2018).
Los trofozoítos de Acanthamoeba spp. se han utilizado
ampliamente como sistemas modelo para estudiar la biolo-
gía de las células eucariotas, debido a su tamaño relativa-
mente grande, rápido crecimiento en cultivo y motilidad ac-
tiva (Caumo et al., 2014). El citoesqueleto bien desarrollado
de estos organismos los convierte en modelos especialmen-
te buenos para comprender la motilidad basada en el citoes-
queleto de actina y otros aspectos moleculares de motilidad
celular (Siddiqui y Khan, 2012).
Por otra parte, estudios de proteómica para Acanthamoe-
ba spp. en etapa de trofozoíto han determinado la variedad
de proteínas expresadas por especies de este género, lo que
ha ayudado a dilucidar los mecanismos moleculares de inter-
acción con las especies huésped y a identificar posibles bio-
marcadores para el diagnóstico y dianas para el desarrollo de
nuevos fármacos y vacunas (Khan, 2006).
Como se mencionó anteriormente, el género Acanthamoe-
ba en ambientes naturales suele alimentarse de bacterias, le-
vaduras, pequeños protozoos, entre otros, por lo que cual-
quiera de ellos puede ser usado como sustrato de crecimiento
en condiciones de laboratorio. Siddiqui y Khan (2012) men-
cionan que existen algunos problemas cuando se usan leva-
duras y pequeños protozoos como sustrato de crecimiento
debido a la complejidad de la preparación del medio. Sin em-
bargo, las sustancias orgánicas como la glucosa, la peptona u
otros sustratos proporcionan nutrientes ricos para organismos
no deseados, es decir, levaduras, hongos, otros protozoos y
bacterias. Para superar estos problemas técnicos y maximi-
zar la probabilidad de aislar únicamente Acanthamoeba de
muestras ambientales y clínicas, se han desarrollado protoco-
los utilizando ensayos de placas petri con bacterias Gram ne-
gativas como sustrato para obtener un gran número de trofo-
zoítos de Acanthamoeba para estudios bioquímicos. Las bac-
terias Gram negativas más utilizadas son Escherichia coli o
Klebsiella aerogenes que se siembran en la placa de agar sin
nutrientes como fuente de alimento para Acanthamoeba. El
agar sin nutrientes contiene nutrientes mínimos y, por lo tan-
to, inhibe el crecimiento de organismos no deseados (Khan
et al., 2002).
Acanthamoeba se puede cultivar ’axénicamente’ en ausen-
cia de organismos alimentarios vivos externos. Esto general-
mente se conoce como cultivo axénico para indicar que no
hay otros organismos vivos presentes. Sin embargo, se consi-
dera que es posible que los cultivos de Acanthamoeba nunca
sean verdaderamente axénicos, ya que pueden contener bac-
terias vivas que sobreviven internamente como endosimbion-
tes (Siddiqui y Khan, 2012). En este sentido, en condiciones
de laboratorio, el crecimiento axénico se logra utilizando me-
dio líquido PYG (Khan, 2001).
A pesar de su distribución extensa en la naturaleza y su
relevancia ecológica, en Ecuador, las investigaciones sobre
este género de amebas son limitadas, lo que resulta en una
falta de métodos estandarizados para su cultivo. La carencia
de estudios específicos ha llevado a la ausencia de protoco-
los establecidos y a una brecha de conocimiento significativa.
Este vacío en la investigación plantea preguntas fundamenta-
les sobre los métodos de cultivo y sus limitaciones, ya que no
se han delineado claramente. Establecer protocolos y com-
prender las posibles restricciones en caso de su existencia se
convierte, por tanto, en una necesidad imperante para abor-
dar este vacío y avanzar en el interés científico en torno a
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estos protozoos en Ecuador.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de cepas Acanthamoeba castellanii ATCC
30010.
La cepa Neff, ATCC 30010, fue donada por la Dra. Ka-
rin Silva Caumo del grupo de Investigación de Proto-
zoarios Emergentes y Oportunistas y el Laboratorio Di-
dáctico de Parasitología Clínica de la Universidad Fede-
ral de Santa Catarina, Brasil; fueron enviadas en viales
de 1,5 ml a temperatura ambiente.
Medios de cultivo para Acanthamoeba castellanii
ATCC 30010
Los medios de cultivo son un requisito indispensable
que se emplea para propagar las células de microorga-
nismos, de este dependerá el crecimiento y rapidez de
reproducción de las mismas. Las cepas de Acanthamoe-
ba castellanii no son la excepción, y se ha encontrado
en la literatura algunos de los medios empleados para
su cultivo, los más relevantes son el medio líquido de
proteasa-peptona-glucosa (PYG) para los cultivos axé-
nicos, es decir, los cultivos de la cepa amebal, y el me-
dio agar no-nutritivo como medio sólido que se vierte
en placas petri para cultivos monoxénicos, es decir, cul-
tivo de la cepa amebal en presencia de otras células, ya
sean bacterianas o virales. Para estos medios se necesi-
tó una serie de reactivos tales como sulfato de magne-
sio, cloruro de calcio, citrato de sodio, sulfato amónico
ferroso, fosfato dihidrógeno de potasio, glucosa, extrac-
to de levadura y peptona (Machado et al., 2022). En el
mercado existen fórmulas preparadas de estos medios,
en especial del PYG, pero, pese a ello, en su mayoría
son para el cultivo de bacterias y cabe recalcar que las
cantidades de los reactivos difieren notablemente para
la siembra de amebas, por lo que en esta investigación
se buscaron las medidas adecuadas para obtener un cre-
cimiento óptimo de la cepa ATCC 30010. Además, para
la elaboración del medio de cultivo sólido, se necesitó
una preparación adicional conocida como solución sali-
na amebal. Esta etapa también implicó una evaluación
detallada para determinar las cantidades apropiadas, así
como la incorporación de gentamicina para prevenir el
crecimiento de otros microorganismos no deseados. La
base para establecer las proporciones adecuadas se de-
rivó de un análisis cuidadoso y consideración de los re-
quisitos específicos del medio, asegurando así la efica-
cia y selectividad del cultivo.
Cultivo de Escherichia coli ATCC 25922 para ser usa-
do como sustrato de Acanthamoeba castellanii ATCC
30010
Acanthamoeba puede interactuar con una serie de mi-
croorganismos, no solo virus, sino también levaduras,
algas e inclusive bacterias. Sin embargo, el mecanismo
de acción de la ameba frente a las bacterias es la depre-
dación. Estudios indican que al poner en contacto a A.
castellanii ATCC 30010 en un medio con E. coli ATCC
25922 existirá una invasión por parte de la cepa amebal
(Yousuf et al., 2013). Así mismo se indica que para el
aislamiento de Acanthamoeba es necesario enriquecer
el medio en el que se la cultive con cepas de bacterias
de E. coli, pues estas servirán como sustrato de la ameba
(Attariani et al., 2020)).
En este sentido, se realizaron cultivos de E. coli ATCC
25922, se sembró 1 l de inóculo microbiano en medio
agar nutritivo mediante siembra por agotamiento en es-
trías, se incubó a 30 °C por 24 horas siguiendo la meto-
dología de Anjum et al. (2021).
Inactivación de Escherichia Coli ATCC 25922 para
ser usado como sustrato de Acanthamoeba castellanii
ATCC 30010
Para que E. coli ATCC 25922 sirva como sustrato de A.
castellanii ATCC 30010 debió ser inactivada, para evi-
tar que el crecimiento de la bacteria inhibiera la repro-
ducción de la ameba. Se emplearon tubos Falcon de 15
ml donde se colocó 5 ml de agua de peptona. Luego con
ayuda de un asa de siembra se tomó una colonia de la
placa de agar nutritivo con cultivo de la bacteria, segui-
do a esto se colocó el asa en posición vertical y se dejó
caer la colonia tomada en el tubo con peptona. Se dejó
incubar a 30 °C por 24 horas. Una vez que se comprobó
el crecimiento de E. coli se tomó 1 ml del cultivo líquido
y se colocó en viales de 1,5 ml, los mismos se llevaron a
baño María a 56 °C por 2 horas Lee y Kaletunç (2010).
Cultivo axénico de Acanthamoeba castellanii ATCC
30010
Con una pipeta de 100 l, se vertió sobre la placa con agar
no-nutritivo 75 l de inóculo de amebas ATCC 30010 y
75 l de E.coli ATCC 25922 inactivas. Las cajas fueron
selladas y etiquetadas con la fecha en la que se reali-
zó, se dejó incubar por 4 días a 30 °C, transcurrido este
tiempo se observó el crecimiento amebal con ayuda de
un microscopio invertido.
Almacenamiento de Acanthamoeba castellanii ATCC
30010
Se sembraron amebas ATCC 30010 en un frasco de cul-
tivo celular (T-75) en medio PYG y se incubaron a 27
°C hasta que se formara una monocapa en el fondo del
frasco. A partir de estos cultivos, se obtuvieron mues-
tras para el almacenamiento, separando las amebas por
medio del método de congelación. Para ejecutar este úl-
timo, se debió reemplazar el medio por 2 ml de PYG
fresco, luego el frasco de medio celular se llevó a con-
gelar a -20 °C por 10 min, posteriormente se tomó 1 ml
del contenido y se colocó en tubos tapa rosca y se al-
macenaron en el refrigerador a 8 °C (Machado et al.,
2022).
RESULTADOS
Protocolo de cultivo axénicos de Acanthamoeba castella-
nii ATCC 30010
Protocolo de cultivo e inactivación de E. coli ATCC 25922
1. Preparar medio de cultivo (se puede preparar Agar nu-
tritivo).
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ESTABLECIMIENTO DE PROTOCOLOS DE CULTIVO ROMÁN-CÁCERES et al.
2. Con ayuda de la probeta tomar 1000 ml de agua destila-
da.
3. Colocar el agua destilada en un matraz de 1000 ml junto
con el medio que se pesó y disolver todo en el agua.
4. Colocar el matraz en la plancha caliente y también dejar
agitar durante 15 min para homogeneizar el medio del
cultivo.
5. Llevar a la autoclave a 120 ºC durante 20 min.
6. Una vez que sale de la autoclave colocar en cajas petri
en un ambiente estéril.
7. Para la inactivación de E. coli se emplean tubos Falcon
de 15 ml donde se debe colocar 5 ml de agua de peptona.
8. Con ayuda de un asa de siembra tomar una colonia de
la placa con cultivo de E.coli en medio sólido (agar nu-
tritivo).
9. Colocar el asa en posición vertical y dejar caer la colo-
nia de E.coli en los tubos con peptona. Tener cuidado,
el asa no deberá tocar las paredes del tubo.
10. En caso de que la colonia no se desprenda con facilidad
se puede dar movimientos de agitación dentro del tubo
hasta que caiga.
11. Dejar los tubos en la incubadora a una temperatura de
30 ºC por aproximadamente 24 horas (los mismos deben
estar sellados con parafilm).
12. Comprobar el crecimiento de E. coli en el medio líqui-
do.
13. Tomar el contenido de los tubos y colocar a aproxima-
damente 1 ml en viales de 1,5 ml, los mismos deben
estar sellados con parafilm.
14. Llevar a baño María los viales a una temperatura de 56
ºC por dos horas.
15. Culminado el proceso E. coli estará inactiva.
Protocolo de cultivo axénico en medio líquido de A. cas-
tellanii ATCC 30010
1. Preparar medio PYG, para lo que se emplean una
gama de reactivos en las siguientes cantidades: pep-
tona (3,75 g), extracto de levadura (0,37 g), sulfa-
to de magnesio (MgSO4,7H2O) (0,49 g), cloruro de
calcio (CaCl2. 2H2O) (0,0295 g), citrato de sodio
(Na3C6H5O7.2H2O) (0,5 g), sulfato de hierro (II) y
amonio [Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H2O] (0,01 g), fosfa-
to dihidrógeno de potasio (KH2PO4) (0,017 g), fosfato
de hidrógeno disódico anhidro (Na2HPO4) (0,1775 g),
glucosa (C6H12O6) (7,5 g) y agua destilada (500 ml).
2. Pesar los reactivos en un recipiente en la balanza analí-
tica y en cuanto al agua destilada se debe ajustar en una
probeta graduada.
3. Tomar un matraz de 200 ml, agregar la cantidad pesa-
da de cloruro de calcio y disolver en 100 ml de agua
destilada.
4. Añadir los reactivos restantes al matraz de 500 ml en el
orden que se ha mencionado previamente y disolver en
aproximadamente 300 ml de agua destilada.
5. Verter la preparación de cloruro de calcio (CaCl2. 2
H2O) en el frasco que contiene los reactivos disueltos
restantes.
6. Luego se coloca en una plancha caliente el matraz con
la solución para facilitar la homogeneización.
7. Llevar la solución al autoclave a 121 ºC durante 20 min.
8. Colocar 5 ml de contenido de amebas (en medio PYG)
en tubos de 15 ml.
9. Llevar los tubos a la centrífuga a 15 rpm por 5 min.
10. Se obtiene un sobrenadante el cual se desecha.
11. El pallet de amebas se deja en los mismos tubos y se les
agrega 5 ml de PYG fresco.
12. Los tubos se llevan a incubar a 30 ºC. Los mismos deben
estar correctamente sellados con parafilm.
Protocolo de cultivo axénico de A. castellanii ATCC
30010 utilizando E. coli ATCC 25922 como sustrato
1. Para el cultivo axénico se prepara agar no nutritivo el
cual necesita de una base previa que es la solución salina
para amebas. Para esta se emplean una serie de reactivos
en las siguientes cantidades: cloruro de sodio (NaCl)
(0,06 g), sulfato de magnesio (MgSO4) (0,002 g), fos-
fato de hidrógeno disódico anhidro (Na2HPO4) (0,071
g), fosfato dihidrógeno de potasio (KH2PO4) (0,068 g),
cloruro de calcio (CaCl2) (0,002 g) y agua destilada
(500 ml).
2. Pesar los reactivos en una balanza analítica y en cuanto
al agua destilada se debe ajustar en una probeta gradua-
da.
3. Añadir en un matraz de 200 ml la cantidad pesada de
cloruro de calcio (CaCl2) y disolver en 100 ml de agua
destilada.
4. Añadir los reactivos restantes a un matraz de 500 ml en
el orden que se ha mencionado previamente y disolver
en aproximadamente 300 ml de agua destilada. Finali-
zado esto se mezcla con la solución de cloruro de calcio.
5. Para que se disuelva de manera más uniforme, llevar a
una plancha caliente la solución.
6. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 min. Para la
preparación del agar sin nutrientes se emplean una serie
de reactivos en las siguientes cantidades: agar-agar (6
g), solución salina amebal estéril de Page (40 ml) y agua
destilada (400 ml).
7. Pesar los reactivos en una balanza analítica y en cuanto
al agua destilada y la solución salina se debe ajustar en
una probeta graduada.
8. Añadir la cantidad pesada de Agar-Agar a la botella de
500 ml y disolver en aproximadamente 300 ml de agua
destilada.
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9. Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 min, una vez que
salga se dispensará el medio en cajas petri y se sellan
con parafilm.
10. Ahora, en cuanto al cultivo monoxénico se emplea el
cultivo de amebas (centrifugadas) en medio PYG, E.coli
previamente inactivas y agar no nutritivo.
11. Con una pipeta de 100 l se esparce el contenido de los
cultivos en cajas petri con agar no nutritivo. La caja debe
contener 75 l de A. castellanii y 75 l de E.coli.
12. Se deja en la incubadora a 30º C por 4-5 días aproxima-
damente donde se podrá observar el crecimiento de las
amebas.
Protocolo de mantenimiento de Acanthamoeba castellanii
ATCC 30010
1. Sembrar la cepa amebal en un frasco de cultivo celular
(T-75) en medio PYG e incubar a 27 ºC hasta que se
forme una capa en el fondo del frasco.
2. A partir de estos cultivos se obtendrán muestras para al-
macenamiento separando las amebas por medio del mé-
todo de congelación suave.
3. En el método de congelación el medio se reemplaza por
2 ml de medio PYG fresco. El frasco de cultivo celular
se lleva a congelar a -20 ºC por 10 min (esto permitirá
que las amebas se despeguen).
4. Seguido a ello se toman muestras de 1 ml y se ponen en
tubos con tapa rosca.
5. Estas muestras se almacenan en el refrigerador a 4 - 8
ºC.
Conteo de células de Acanthamoeba inoculadas en me-
dio PYG
Las células amebales formaron una monocapa de tono
transparente en la parte inferior de los frascos de cultivo ce-
lular (T-75). Se han observado en un microscopio invertido
en lente 10x comprobando que existe una confluencia del 90
- 100%, además en el lente 40x se determinó que las células
estaban en su etapa de trofozoíto lo cual indica la viabilidad
y buen estado de las mismas, también se observó la presen-
cia de núcleos prominentes y vacuolas contráctiles. El conteo
de células mostró que en promedio existen aproximadamente
2,8 x 106 células por mililitro (figura 1).
DISCUSIÓN
La reproducibilidad de resultados de investigación está li-
gada a la protocolización de los métodos y técnicas utiliza-
das, aún más cuando se trata de métodos de cultivo y man-
tenimiento de microorganismos. A pesar de que varias con-
diciones de nutrientes, temperaturas y rangos de pH, entre
otras, pueden permitir la subsistencia de un organismo, las
variables del medio en que proliferan y se mantienen pueden
acabar siendo factores que interfieran con los resultados de
los experimentos que se lleven a cabo con dicho organismo
o que conduzcan a diferentes resultados (Raymond Choo et
Fig. 1: A: Acanthamoeba castellanii ATTCC 30010 vista en
microscopio invertido en lente 10x; se observa una confluencia del
100% de las células amebales. B: A. castellanii ATCC 30010 en
las rejillas de la cámara de Neubauer. C: A. castellanii ATTCC
30010 vista en microscopio invertido en lente 40x.
al., 2006). Es por esta razón, que la estandarización de proto-
colos de cultivo y mantenimiento de Acanthamoeba emerge
como una necesidad.
Las amebas del género Acanthamoeba son un excelente
modelo de organismo hospedador que puede ser utilizado en
el laboratorio para el estudio de patógenos a los que alberga y
protege: bacterias, hongos y principalmente virus cuyo cul-
tivo es complejo y dependiente de células que les permitan
completar su ciclo de vida (Khan, 2006).
La propagación de las amebas del género Acanthamoeba
en medio axénico es necesaria para el mantenimiento de cul-
tivos puros en el laboratorio y como se muestra en los re-
sultados, el medio PYG resulta ser el más adecuado (Byers,
1979). A pesar de la existencia de este medio preparado en
formulación comercial, el requerimiento de cantidades sig-
nificativas hace que la preparación de este sea más atractiva
desde el punto de vista costo-beneficio. Los reactivos son co-
munes a una gran cantidad de medios de cultivo microbio-
lógico y, por esta razón, son de fácil acceso y disponibili-
dad en laboratorios de microbiología. Asimismo, el cultivo
en medio líquido permite verificar parámetros físicos, como
la turbidez, de manera sencilla para determinar posibles con-
taminaciones además del monitoreo del crecimiento de las
amebas (Penland y Wilhelmus, 1997).
Para el cultivo de las amebas en medio PYG, los tubos có-
nicos de 50 ml resultan especialmente útiles pues permiten
la propagación amplia de los microrganismos. No obstante,
es importante que se considere la disponibilidad de una cen-
114
ESTABLECIMIENTO DE PROTOCOLOS DE CULTIVO ROMÁN-CÁCERES et al.
trífuga adecuada para dichos tubos que será necesaria para
el lavado y recolección de las amebas previa su refrigeración
o traspaso a cultivos monoxénicos. En caso de ser necesario
se recomienda utilizar tubos cónicos de 15 ml, el pasaje de
las amebas deberá ser más frecuente puesto que existe menos
disponibilidad de superficie de adherencia.
Debido a que las amebas son organismos eucariotas que
naturalmente se alimentan de bacterias, el cultivo monoxéni-
co, es decir el cultivo en que se utiliza un medio poco nutriti-
vo y el sustrato consiste en una capa de bacterias, es altamen-
te efectivo para el crecimiento y reproducción de estas (Pen-
land y Wilhelmus, 1997). Para el diseño del medio de cultivo,
fue importante tener en cuenta que existiera la mínima can-
tidad de nutrientes. El razonamiento de esta preparación es
que las bacterias E. coli no deben ser capaces de alimentarse
y reproducirse, pues la velocidad de crecimiento de las bac-
terias es mucho mayor que la velocidad de reproducción de
las amebas. De ser el medio en exceso nutritivo, las bacte-
rias competirían por recursos con las amebas y existiría un
sobrecrecimiento que resultaría perjudicial para el adecuado
mantenimiento de las amebas (Byers, 1979). La formulación
del medio que se propone en este trabajo asegura la supervi-
vencia de bacterias y amebas, pero favorece la proliferación
de las amebas. Aquí también es relevante que se tenga en
cuenta que, por la composición de agar en el medio, las cajas
deben mantenerse como máximo 4 - 5 días en la incubadora
y que un nivel de condensación que resulte en gotas de agua
sobre la superficie se considera normal.
En este mismo tema, la inactivación de las bacterias es un
paso crítico, justamente por la velocidad de proliferación de
estas (Goldblith y Wang, 1967). Este paso es indispensable
para asegurar que las amebas puedan utilizar a las bacterias
como alimento. Durante la inactivación se puede utilizar me-
dio PYG, solución salina para amebas o idealmente agua de
peptona y se recomienda sellar el tubo con Parafilm para evi-
tar contaminaciones. El tiempo para la inactivación ideal es
de dos horas a una temperatura baja (56 grados centigrados),
de esta manera, las bacterias no están muertas en su totali-
dad, sino que están en un estado inactivo que les dificultará
la proliferación en la placa y serán presa fácil de las amebas
(Goldblith y Wang, 1967).
CONCLUSIONES
Estos protocolos permiten la viabilidad de células de
Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 cultivado en condi-
ciones de laboratorio. Usando cantidades adecuadas tanto de
inóculo como de reactivos para realizar los medios de cultivo
se logró la propagación de la cepa ATCC 30010.
En los protocolos se establecen los pasos necesarios para
la obtención de cultivo de Acanthamoeba castellanii ATCC
30010 en medio líquido PYG así como en medio sólido utili-
zando agar no-nutritivo y Escherichia coli ATCC 25922 co-
mo su fuente de sustrato, indicando las condiciones ambien-
tales óptimas para su replicación en laboratorio.
AGRADECIMIENTOS
Queremos expresar nuestro sincero agradecimiento a la
Dra. Karin Caumo de la Universidad de Santa Catarina, Bra-
sil, por su generosa donación de cepas de Acanthamoeba cas-
tellanii. Su invaluable contribución enriqueció significativa-
mente nuestros esfuerzos de investigación y desempeñó un
papel crucial en el éxito de nuestros estudios.
Además, extendemos nuestro más sincero agradecimiento
a la Ingeniera Fernanda Jaramillo por su dedicada participa-
ción en la parte práctica de los cultivos.
Estas personas han realizado contribuciones significativas
a nuestro proyecto, y estamos verdaderamente agradecidos
por su apoyo y colaboración.
CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES
Conceptualización: DRC y JAR; metodología; DRC, ASV,
AVT Analisis formal: DAC; investigacion: DRC, ASV, AVT
recursos: DRC y JAR; redaccion — preparacion del borrador
original: DAC, AVT; redaccion — revision y edicion: DRC;
visualizacion: DRC y JAR; supervision: JAR; administracion
de proyecto: DRC y JAR; adquisicion de financiamiento para
la investigacion: DRC y JAR. Todos los autores han leido y
aceptado la version publicada del manuscrito.
FINANCIAMIENTO
Este estudio se llevo a cabo con financiamiento propio y
de la Universidad Nacional de Loja, con el proyecto 18-DI-
FARNR-2021 titulado “Identificación fısica y molecular de
un nuevo virus nucleocitoplasma tico de ADN de gran tama-
ño (NCDLVs), presente en cuerpos lacustres de la provincia
de Loja, por medio de la infeccion de cultivo de Acanthamoe-
ba castellanii” otorgado por la Direccion de Investigacion a
Daniela Román-Cáceres y al grupo de investigacion de Ge-
nética y Biología Molecular de la UNL.
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