e-ISSN: 1390-5902
CEDAMAZ, Vol. 14, No. 1, pp. 8–13, Enero–Junio 2024
DOI: 10.54753/cedamaz.v14i1.1948
Detección de Leptospira patógena en hembras bovinas de edad reproductiva
en la provincia de Morona Santiago
Pathogenic Leptospira detection in bovine females of reproductive age in Morona
Santiago
Danilo Ismael Arévalo Torres1,*, Víctor Montes- Zambrano2y Jhuliana Luna-Herrera1
1Facultad Agropecuaria y de Recursos Naturales Renovables, Universidad Nacional de Loja. Loja-Ecuador, diat0170@gmail.com,
jhuliana.luna@unl.edu.ec
2Departamento de Veterinaria, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Técnica de Manabí, Manabí-Ecuador,
victor.montes@utm.edu.ec
*Autor para correspondencia: diat0170@gmail.com
Fecha de recepción del manuscrito: 01/02/2024 Fecha de aceptación del manuscrito: 01/06/2024 Fecha de publicación: 30/06/2024
Resumen—La leptospirosis es una enfermedad zoonótica, causada por patógenos del género Leptospira, además es considerada como
una enfermedad reproductiva que provoca elevadas pérdidas económicas en la ganadería bovina debido a abortos, infertilidad, disminución
de la producción láctea y muerte de animales. Estudios serológicos realizados en el Ecuador han demostrado la circulación frecuente de
serovares como: Pomona, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Canicola, Bataviae, Hardjo, Australis, Sejroe, entre otros; sin embargo, las
limitaciones de la serología hacen necesario el uso de técnicas moleculares para la detección del patógeno y sus sitios de colonización.
En la provincia de Morona Santiago, no existen estudios relevantes sobre la detección de Leptospira patógena, por lo que, el presente
estudio buscó identificar la presencia del patógeno en hembras bovinas de edad reproductiva faenadas en el cantón Gaulaquiza, mediante
un estudio observacional de tipo transversal en el camal municipal del cantón Gualaquiza. Se muestrearon 50 hembras bovinas para la
obtención de suero sanguíneo, orina y lavado uterino con el fin de diagnosticar leptospirosis mediante MAT (aglutinación microscópica) y
PCR convencional (gen hap 1). Se detectó Leptospira patógena en el 8% de los animales estudiados, por lo que se sugiere a los ganaderos
y personal de la zona de estudio se instauren medidas de bioseguridad necesarias para reducir la transmisión en las poblaciones de animales
y hacia el ser humano.
Palabras clave—Leptospirosis genital, hap 1, Enfermedad abortiva, MAT.
Abstract—Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic species of the genus Leptospira. It is also a significant reproductive
disease in cattle, leading to substantial economic losses due to abortions, infertility, decreased milk production, and animal mortality. Sero-
logical studies in Ecuador have revealed frequent circulation of serovars such as Pomona, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Canicola,
Bataviae, Hardjo, Australis, and Sejroe. However, the limitations of serology necessitate the use of molecular techniques to accurately de-
tect the pathogen and its colonization sites. In Morona Santiago province, there are no relevant studies on pathogenic Leptospira detection,
therefore this study aimed to identify the presence of the pathogen in reproductive-age bovine females in the municipal feedlot of Guala-
quiza canton through a cross-sectional observational study. Fifty female cattle were sampled for blood serum, urine, and uterine lavage to
diagnose leptospirosis using microscopic agglutination (MAT) and conventional PCR (hap1 gene). Pathogenic Leptospira was detected in
8% of the animals. It is recommended that farmers and personnel implement necessary biosecurity measures to reduce transmission among
animals and to humans.
Keywords—Genital leptospirosis, hap 1, Abortive disease, MAT.
INTRODUCCIÓN
La infección por Leptospira patógena en bovinos produ-
ce un impacto reproductivo en los animales a conse-
cuencia de la colonización renal y uterina; causa un alto im-
pacto económico por las pérdidas de producción de los ha-
tos ganaderos debido a la presentación de signos como: fie-
bre, anemia hemolítica aguda con hemoglobinuria, abortos,
infertilidad, disminución de la producción láctea y muerte,
además constituye un riesgo para las personas que laboran
en el manejo de los animales (Boey et al., 2019; Figueredo et
al., 2017; Koval et al., 2020)
Los roedores son los principales reservorios y agentes di-
seminadores del patógeno, mientras que los hospederos ac-
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DETECCIÓN DE LEPTOSPIRA PATÓGENA ARÉVALO TORRES et al.
cidentales en donde se desarrolla la enfermedad son la ma-
yoría mamíferos incluido el ser humano; en los bovinos se
puede presentar de forma aguda, subaguda o crónica (Pache-
co, 2015; Zeni, 2018). Cada serovariedad de la bacteria está
adaptada a determinados hospedadores mamíferos (Pacheco,
2015), siendo los bovinos hospedadores naturales de Leptos-
pira borgpetersenii serovar Hardjo (Hardjobovis), y Leptos-
pira interrogans serovar Hardjo (Hardjoprajitno) que pueden
colonizar y mantenerse en el tracto genital de vacas y toros
infectados (da Silva et al., 2019); sin embargo, como ocurre
con otras especies puede existir la presencia de otros serova-
res incidentales con consecuencias clínico patológicas más
severas (Monroy et al., 2020; Ramos, Cruz, et al., 2019)
Las personas y animales pueden estar expuestos a la bac-
teria por contacto directo o indirecto con la orina de anima-
les infectados. El contagio puede darse también por la vía
vertical, de la madre al feto o al neonato a través de trans-
misión transplacentaria o transmamaria, respectivamente, así
como también por vía sexual dentro de las especies (Boey
et al., 2019); en los bovinos se consideraba la infección del
tracto genital un efecto secundario de la infección renal; sin
embargo, la leptospirosis genital debe considerarse como un
síndrome específico, en donde algunas cepas, del serogrupo
Sejroe, colonizan el tracto genital (Loureiro & Lilenbaum,
2020).
El diagnóstico de la enfermedad es complicado, sobre to-
do considerando la inespecificidad de los signos clínicos aún
en infecciones incidentales. El método “Gold-standard” para
el diagnóstico es el Test de Micro Aglutinación (MAT) ba-
sado en la detección y titulación de anticuerpos producidos
contra los antígenos de los serovares (Samrot et al., 2021).
Sin embargo, dadas las limitaciones en la sensibilidad de la
prueba, es necesario recurrir a técnicas más sensibles y espe-
cíficas que permitan la detección del agente en los diferentes
órganos, con el fin de establecer el impacto sobre la salud
del individuo y las poblaciones susceptibles a la infección.
Actualmente se han desarrollado protocolos de diagnóstico
mediante PCR con alta sensibilidad y especificidad (Hamer
et al., 2019). cuya mayor ventaja radica en que es posible
detectar el ADN incluso cuando las bacterias no son viables
(Grune et al., 2021).
En estudios realizados en diferentes localidades del Ecua-
dor las serovariedades identificadas con mayor frecuen-
cia han sido, por ejemplo, en Manabí: Pomona, Icterohae-
morrhagiae, Grippotyphosa (Burgos et al., 2019); Loja: Ca-
nicola y Bataviae (Luna et al., 2019); Chimborazo: Canicola,
Hardjo y Pomona (Ordóñez et al., 2021); El Pangui: Austra-
lis, Sejroe y Bataviae (Muyulema, 2020).
Al considerarse una enfermedad subdiagnosticada con
consecuencias serias en la salud reproductiva de los anima-
les, que puede generar un alto impacto económico en las
ganaderías, el presente estudio tuvo como objetivo detectar
la presencia de Leptospira patógena en hembras bovinas de
edad reproductiva del cantón Gualaquiza de la provincia de
Morona Santiago, mediante PCR convencional (gen hap 1), y
a la vez detectar anticuerpos anti Leptospira en los animales
incluidos en el estudio
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar de ejecución y período
Fig. 1: Mapa de ubicación de la parroquia Gualaquiza, provincia
de Morona Santiago
El presente estudio se desarrolló en el camal municipal
del cantón Gualaquiza ubicado al suroeste de la provincia de
Morona Santiago, durante los meses de junio y julio de 2022,
en el que se faenan al mes un promedio de 100 bovinos de
diferentes edades y razas.
Diseño de la investigación
El presente es un estudio observacional de tipo transver-
sal, que se ejecutó en dos fases; una fase de campo en la
que se recogió muestras de sangre, orina y lavado uterino e
información perteneciente a los animales; y, una fase de la-
boratorio, en la que se detectó anticuerpos contra Leptospira
spp. mediante aglutinación microscópica (MAT) y el agente
patógeno mediante diagnóstico por PCR convencional (gen
hap1).
Tamaño de la muestra y tipo de muestreo
Se realizó un muestreo no probabilístico durante los meses
de junio y julio de 2022, habiéndose seleccionado 50 hem-
bras bovinas de edad reproductiva (sobre los 14 meses de
edad) según el ingreso al matadero en el periodo de estu-
dio considerado; estos criterios fueron considerados dada la
naturaleza de la investigación, que discute el impacto de la
infección por Leptospira sobre la salud reproductiva de los
animales. El número de animales se determinó en función de
la capacidad de faenamiento del matadero y el tiempo con-
templado para la investigación.
Registro de información de campo
La información obtenida que se registró en cuanto a la
edad, raza y estado reproductivo fue organizada en registros
de campo, en los cuales, además, se asignó un código para la
identificación de cada animal.
Toma, transporte y conservación de muestras biológi-
cas
Las muestras de sangre fueron extraídas por venopunción
de la vena yugular en cantidad de 10 ml, utilizando tubos
vacutainer sin anticoagulante. Las muestras de orina fueron
obtenidas durante el proceso de evisceración mediante cis-
tocentesis en cantidad de 3ml en tubos de reacción (Eppen-
dorf). Para la colecta de la muestra del tracto reproductor,
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luego del proceso de evisceración se introdujo en el útero
una sonda Foley, a través de la cual se administró suero fi-
siológico al 0.9% en cantidad aproximada de 15 ml, para
posteriormente realizar un masaje del órgano y extraer 10 ml
de lavado uterino, colocando en tubos Falcon estériles.
Para la obtención de suero sanguíneo se utilizó una cen-
trifuga de campo a 1500 g durante 10 minutos. Las muestras
fueron identificadas y transportadas en condiciones adecua-
das a los laboratorios del Centro de Biotecnología de la Uni-
versidad Nacional de Loja
Detección de anticuerpos y determinación de serova-
res mediante aglutinación microscópica (MAT)
La detección de anticuerpos contra Leptospira patógena se
realizó por medio de la técnica de MAT. Se empleó un panel
de siete serovares de antígenos vivos de Leptospira borgpe-
tersenii serovar Sejroe, Leptospira interrogans serovares Ca-
nicola, Tarassovi, Bataviae, Pomona, Wolffi y Hardjo.
Con respecto al proceso de titulación se siguió el proce-
dimiento recomendado por el Manual de Código Terrestre,
en donde se sugiere realizar diluciones dobles del suero, las
mismas que se realizaron hasta 1/1600. Se consideró además
que en caso de detectarse coaglutinaciones la muestra se con-
sidera positiva con el serovar con la titulación más alta (OIE,
2021).
Detección de Leptospira spp. mediante PCR conven-
cional
Las muestras de orina fueron sometidas a un proceso de es-
tabilización y concentración (Stoddard, 2013). El protocolo
de extracción consistío en utilizar 500 ul de buffer de lisis que
contiene EDTA, SDS, TRIS, ClNa y 5 ul de proteinasa K so-
metidas a una incubación por una hora a 56ºC, después de ese
tiempo se aplicó etanol al 100% para provocar precipitación
del ADN (Matamala Vera, 2024). La detección del material
genético bacteriano se realizó por PCR convencional para el
gen hap1 de 262 pb, perteneciente a Leptospira patógena (re-
verse primer “TGTTGGGGAAATCATACGAAC”; forward
primer “GCAAGCATTACCGCTTGTGG”) (Branger et al.,
2005). La amplificación de PCR consistió en un ciclo inicial
de 5 min a 95 °C seguida de 45 ciclos de 15 seg a 94 °C,
35 seg a 56 °C y 40 seg a 72 °C; la extensión final fue reali-
zada durante 10 min a 72 °C. Los productos de PCR fueron
cargados en gel de agarosa al 1,5% teñido con SYBR Safe
y cargados con buffer de carga 6X y sometidos a 100 voltios
por 40 minutos. Para la visualización a partir de electrofo-
resis, se colocó el gel sobre un transiluminador de luz azul
(safe imagen 2.0 Invitrogen) para determinar el peso mole-
cular de las bandas obtenidas del producto de PCR se utilizó
un marcador de peso molecular de 50 pb.
Definición de caso
Se consideró un caso positivo a leptospirosis a cualquier
animal con resultado PCR positivo a partir del procesamiento
de las muestras de orina o útero, acompañado o no de un
resultado positivo en MAT con un punto de corte >1:100.
Todo el proceso serológico y molecular se llevó a cabo en
el Laboratorio de Leptospira de la Universidad Técnica de
Manabí.
El análisis estadístico
Los resultados obtenidos del diagnóstico se analizaron me-
diante estadística descriptiva empleando tablas de frecuencia
para expresar datos en porcentaje respecto a la edad y la raza
de los animales. Para establecer la relación entre la coloni-
zación renal o uterina con el serovar infectante se consideró
realizar el test Chi cuadrado y/o Test de Fisher tomando en
cuenta un valor de pmenor a 0,05 como estadísticamente sig-
nificativo. El análisis se realizó en el software estadístico R
versión 4.3.2.
RESULTADOS
Características de los animales estudiados
Los animales considerados para el estudio fueron 50 hem-
bras bovinas de edad reproductiva entre los 14 y 60 meses,
criollas (10%), de razas mestizas Charoláis (35%), Brown
Swiss (8%) y Holstein Friesian (2%).
Resultados del diagnóstico serológico de leptospirosis
en hembras bovinas faenadas en el cantón Gualaqui-
za
No hubo ningún animal seropositivo en MAT consideran-
do un punto de corte de 1/100; sin embargo, una muestra de
suero de un animal mostró aglutinación en una titulación de
1/50 frente al serovar Bataviae.
Resultados del diagnóstico mediante PCR convencio-
nal
Se detectó Leptospira mediate PCR convencional (hap 1)
en cuatro animales. Dos de las 50 muestras de orina resulta-
ron positivas confirmando la eliminación de la bacteria por
esta vía; mientras que dos animales fueron positivos a par-
tir de muestras uterinas. Las muestras de orina con resultado
positivo a PCR corresponden a un animal mestizo de 48 me-
ses de edad y una hembra Charoláis de 16 meses de edad,
mientras que en las muestras uterinas pertenecen a una hem-
bra Brown Swiss de 36 meses de edad y una Charoláis de 24
meses de edad.
DISCUSIÓN
Diagnóstico serológico
Los resultados negativos encontrados en el presente estu-
dio mediante la prueba de MAT podrían indicar la ausencia
de la enfermedad en su fase aguda; estos resultados contras-
tan con los reportado en la amazonía recientemente, especí-
ficamente en el cantón El Pangui, en donde se encontró una
prevalencia del 12,21% (Muyulema Erazo, 2020), lo que po-
dría atribuirse al diseño de este estudio, en el que no se con-
sideró un muestreo aleatorio en la población de bovinos del
cantón. Es importante señalar además que la sensibilidad de
la prueba depende del panel de serovares utilizado por lo que
no puede descartarse la posibilidad de la existencia de ani-
males seropositivos con el uso de un panel diagnóstico más
amplio; asimismo, MAT tiene limitaciones para la identifi-
cación de animales enfermos crónicos, que pueden abortar o
ser portadores renales y genitales con títulos por debajo de
10
DETECCIÓN DE LEPTOSPIRA PATÓGENA ARÉVALO TORRES et al.
1/100 (OIE, 2021).
El resultado de la aglutinación de 1/50 para el serovar Ba-
taviae en una de las muestras analizadas en este estudio, pro-
bablemente se atribuye a una infección crónica en donde la
presencia de títulos bajos de anticuerpos indica la exposición
del animal frente al agente patógeno. Bataviae ha sido un se-
rovar reportado en especies silvestres de roedores (Benacer
et al., 2016), lo que podría sugerir una interacción entre estos
hospedadores de mantenimiento y los animales domésticos
como el ganado bovino.
En otros estudios realizados en el Ecuador se han reporta-
do diversos serovares, así por ejemplo en el cantón El Pan-
gui (a 25 km del cantón Gualaquiza) se encontraron anima-
les positivos para el serovar Australis, por lo que habría que
considerarlo para futuras investigaciones; mientras tanto, en
Manabí la seroprevalencia encontrada fue del 57,38% en el
2019 utilizando un panel de ocho serovares, en donde el se-
rovar Pomona fue el más frecuente (Burgos et al., 2019); asi-
mismo, en Loja la prevalencia reportada para el 2019 fue del
30,08% en un panel de dieciocho serovares, siendo los sero-
vares más frecuentes Canicola y Bataviae (Luna et al., 2019).
Estudios con la técnica de MAT en Colombia en el De-
partamento de Antioquia, demostraron una prevalencia del
69,9%, en vacas con problemas reproductivos (Suárez et
al., 2017); mientras que, en México, en un estudio de hem-
bras bovinas en edad reproductiva, la unidad de producción
presentó una frecuencia de 24,1% (Ramos, Romero, et al.,
2019). Es probable que en estas investigaciones las seropre-
valencias sean más elevadas por cuanto los animales selec-
cionados tenían antecedentes de problemas reproductivos.
Detección de Leptospira patógena
Leptospira spp. puede encontrarse circulantes en la sangre,
orina, tejidos y en los órganos reproductivos de los animales
infectados. Transcurrida la fase de leptospiremia, pueden eli-
minarse de forma intermitente durante la micción, pero al no
ser detectada en la orina no se descarta que el animal sea
un portador renal crónico (Urioste, 2021). En este estudio al
analizar muestras serológicas por MAT se obtuvo resultados
negativos; por medio de detección molecular en muestras de
orina y útero se obtuvo 4 resultados positivos.
En estudios similares en bovinos hembras en edad repro-
ductiva, en Brasil se detectó ADN de Leptospira spp. en el
66,7% de animales (Aymée et al., 2021), demostrando una
cifra importante en bovinos con baja eficiencia reproductiva
por la colonización genital de la bacteria; así mismo, en un
estudio realizado en un camal de Río de Janeiro en vacas no
gestantes, el 26,2% fueron positivas, las muestras analizadas
fueron de sangre y fragmentos uterinos (di Azevedo et al.,
2020). La colonización de la bacteria en el tracto reproduc-
tivo genera pérdidas en la producción y reproducción de las
ganaderías.
La detección del patógeno en la orina ha sido el procedi-
miento de elección para demostrar el estado de portador renal
de los animales infectados, así, por ejemplo, a partir de mues-
tras de orina de bovinos tomadas en un camal municipal del
estado de Paraná, Brasil, se estimó una frecuencia de 14,9%
(Guedes et al., 2019). La presencia de la bacteria en el útero
puede interferir en la concepción y el desarrollo embriona-
rio, a la vez, la detección renal de la bacteria demuestra el
tropismo que tiene por dicho órgano (Urioste, 2021).
En este estudio, se detectó Leptospira patógena en el 4%
(2/50) de las muestras de orina y en el 4% (2/50) de las mues-
tras uterinas, totalizando 4 hembras bovinas con diagnóstico
positivo a PCR (hap1). Sin embargo, la frecuencia de detec-
ción ha sido mayor en la provincia de Manabí, ya que en 72
muestras de orina se obtuvo 10 muestras positivas en PCR
para detección del gen rrl (Revelo et al., 2020).
La sensibilidad de diagnóstico de la técnica molecular
PCR, permite utilizarle como complemento de la prueba se-
rológica MAT, durante los primeros días de enfermedad o
cuando se carece de muestras pareadas, permitiendo un diag-
nóstico preciso (Sandoval et al., 2018). En esta investigación
los animales PCR positivos, no fueron seropositivos, y solo
uno fue positivo con titulación baja (1/50 para Bataviae).
La presencia de Leptospira en el útero de las vacas interfie-
re con la implantación del embrión u otros eventos tempranos
de la preñez, los mecanismos de defensa son afectados por
los cambios de pH intrauterino y por la actividad hormonal,
permitiendo una invasión de agentes infecciosos generando
una respuesta inflamatoria (Mosquera et al., 2022); en el es-
tado de portador renal permite la persistencia y su multipli-
cación, siendo eliminado por la orina por largos periodos de
tiempo, generando en el animal portador diferentes cuadros
clínicos (García et al., 2014).
La detección de leptospiras en orina y útero por técnicas
moleculares de PCR, permite establecer que existe la presen-
cia de la infección en la zona, la transmisión de la bacteria
puede ser atribuida a diversos factores como causas ambien-
tales o entre animales, generando perdidas en la producción
y reproducción en las ganaderías de bovinos.
CONCLUSIONES
No se detectaron animales con anticuerpos contra Leptos-
pira patógena en MAT en un punto de corte de 1/100; sin
embargo, en un animal se detectó aglutinación en una dilu-
ción de 1/50 (Bataviae), que por su resultado PCR positivo,
se sugiere que es un animal que ha estado expuesto a Leptos-
pira spp. y que mantiene colonización renal del patógeno.
En el análisis de las muestras de útero y orina por PCR
convencional, se obtuvo una frecuencia de animales positi-
vos del 8%, lo que indica la presencia de la infección en las
diferentes ganaderías del cantón Gualaquiza, siendo un ries-
go sanitario para las personas que laboran en el cuidado de
los animales y personal que trabajan en el camal.
No se pudo determinar la relación de serovares infectan-
tes y el tipo de colonización uterina y renal, en las hembras
bovinas en edad reproductiva.
AGRADECIMIENTOS
Gratitud al personal técnico del centro de faenamiento del
matadero municipal de Gualaquiza y a los académicos de la
Universidad Nacional de Loja y de la Universidad Técnica
de Manabí
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